非洲猪瘟病毒蛋白结构及疫苗研究进展.pdf
《非洲猪瘟病毒蛋白结构及疫苗研究进展.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《非洲猪瘟病毒蛋白结构及疫苗研究进展.pdf(7页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、养殖与饲料 2024 年第 4 期非洲猪瘟病毒蛋白结构及疫苗研究进展王红帅,谢水华,刘建营,郭建超,李亮,陈迎丰*广东省农业技术推广中心,广州 510520摘要 非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的1种高致死性传染病。自ASF疫情暴发以来,ASF对全球养猪业造成巨大损失。ASFV是由许多蛋白质组成的复杂结构,这些蛋白的功能和作用机制研究尚不清楚,以及复杂的免疫逃逸机制,使得疫苗开发极具困难。为此,解析ASFV蛋白的结构和功能将有助于更清楚地了解病毒与宿主之间的相互作用,以及ASFV的复制和传播机制,有助于筛选保护性抗原,并设计更有针对性和更有效的ASF疫苗。本文总结了近年来AS
2、FV蛋白结构功能和疫苗开发方面的研究进展和突破,以期为科学防控非洲猪瘟提供参考。关键词 非洲猪瘟;非洲猪瘟病毒;蛋白结构;ASF疫苗非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染家猪和野猪引起的1种急性、热性、出血性和高度致死性病毒性传染病,该病发病快、病程短,强毒株的死亡率可高达 100%,被列为 1 种法定应报告的疾病(必须向世界动物卫生组织(WOAH)报告),也是我国重点防范的一类动物疫病。ASF于20世纪20年代起源于非洲,并于2007年传播到格鲁吉亚的高加索地区,迅速传播到俄罗斯(2007
3、年)、乌克兰(2012年)、波兰(2014 年)、比利时(2018 年)、中国(2018年)、越南(2019年)、印度(2020年)等许多国家和地区1。2018 年 8 月,我国首次在沈阳发现 ASF 疫情后,继而该病来势汹汹,据不完全统计,截至2023年12月底,全国报告发生ASF疫情约207起,累计扑杀生猪超123万头,给我国生猪养殖业造成了巨大损失。从数据上看,2018年我国发生非洲猪瘟 99起,2019年63起,2020年19起,2021年14起,2022年1起,相比往年,疫情报告数量、扑杀生猪数量大幅下降,但2023年我国发生非洲猪瘟11余起,疫情出现了反弹,且处于点状发生态势。AS
4、FV具有许多蛋白质组成的复杂结构,这些蛋白的功能和作用机制研究尚不清楚,以及复杂的免疫逃逸机制,使得疫苗开发极具挑战性,至今仍无安全有效的疫苗上市。因此,有必要研究ASFV蛋白的结构和功能,作为抵御病毒感染机制的1种手段,为制备ASF疫苗提供参考。1ASFV结构与组成ASFV 是 1 种有囊膜的单分子线双链 DNA 病毒,是猪病毒科的唯一成员。ASFV病毒颗粒的整体形状为正二十面体,直径为260300 nm,由内向外分别由病毒拟核、核衣壳、内膜、衣壳和外膜组成,病毒细胞内和细胞外都具有传染性2。其中,拟核参与合成和修饰早期RNA转录时所需要的酶,这些酶参与ASFV致病机制的调控,如DNA结合蛋
5、白收稿日期:2023-12-03作者简介:王红帅,男,1988年生,硕士,兽医师。*通信作者:陈迎丰,男,1966年生,硕士,正高级畜牧师。71养殖与饲料 2024 年第 4 期p10。核衣壳主要由p150、p37、p34、p14、p35和p15等6种成分组成,内膜含有p54、p17蛋白,衣壳含有p72、p49蛋白,外膜是典型的跨膜蛋白,并且与T淋巴细胞表面的黏附受体CD2序列同源,因此又称为CD2v。病毒基因组长度170193 kb,包含151167个开放阅读框,编码超过50种结构蛋白和超过100种非结构蛋白,且ASFV基因编码的蛋白质1/2以上属于未知功能的蛋白质2。2ASFV蛋白结构和功
6、能的研究进展2.1ASFV进入ASFV是通过受体介导的内吞作用进入宿主细胞,这个过程需要动力蛋白,病毒利用动力蛋白促进内化和细胞内运输。p54与动力蛋白相互作用3,而pE248R参与膜融合,从而促进ASFV感染3。p54 是 1 种位于外膜上由 E183L 基因编码的跨膜蛋白,包含 1 个跨膜结构域和二硫键合的同源二聚体结构。p54的 13个氨基酸结构域与 LC8结合,形成扩膜结构域,参与病毒的复制。在病毒复制发生过程中,LC8 与 p54 蛋白的相互作用可能使病毒利用宿主细胞来促进病毒的运输和复制4。因此,对 p54结构的分析可能有助于了解这种相互作用机制,并能够在关键早期阶段阻断ASFV感
7、染。pE248R 蛋白是由 E248R 基因编码的蛋白,主要由分子内二硫键、肉豆蔻酰化位点和疏水跨膜区域结构构成。pE248R与VACV蛋白L1具有高度的氨基酸序列相似性,而VACV蛋白L1是病毒多蛋白进入融合复合物的重要组成部分,在ASFV病毒粒子通过细胞质液泡膜的过程中可能发生膜融合,随后将ASFV病毒注入细胞质,pE248R基因缺失会降低ASFV的传染性。此外,ASFV的进入与pE248R和pE199L组成的融合机制紧密相关5。因此,进一步研究该蛋白及其融合机制可能揭示ASFV进入和进入后通路的机制。2.2ASFV复制pS273R 是 1 种特异性的 SUMO-1 半胱氨酸蛋白酶,由 1
8、2 个-螺旋、7 条 链和 1 个螺旋组成,它们折叠成 2 个紧密但不同的结构域:核心结构域和ASFV特有的臂结构域,构成1个催化三联体(C232-H168-N187),pS273R 蛋白酶可催化 pp220和 pp62多蛋白前体成熟为核壳蛋白 p5、p34、p14、p14、p37、p150、p15、p35、p8、ISG15 和 SUMO6。Li等7针对pS273R设计了四肽丁腈化合物靶向抑制剂,这些抑制剂结合了该酶的活性位点,从而为基于 ASFV 蛋白结构的抗病毒药物的设计提供参考。pp220是1种CP2475L基因编码的N-肉豆蔻酰化的前体多肽,能够促进发育中的核心壳与内包膜的结合,pp2
9、20经裂解加工后形成病毒主要的结构蛋白p150、p37、p34和p14,抑制CP2475L基因的表达,将会导致病毒核衣壳和 DNA 的部分缺失,pp220可能作为 1个蛋白支架的作用,连接核衣壳和外部包膜8。p37是1个由ASFV基因组编码的核质穿梭蛋白,在 ASFV 复制周期中,参与了病毒 DNA 复合物的形成,从而进入细胞核启动 DNA 复制,并参与病毒 DNA 的核运输。研究9表明,p37 既通过CRM-1 受体介导进入细胞核,又从细胞核输出到细胞质。pP1192R 是 1 种由 ORF P1192R 基因编码的DNA拓扑异构酶,能够缓解pA104R与DNA结合所产生的拓扑张力,在ASF
10、V基因组复制中发挥积极作用。Coelho 等10对 pP1192R 的结构分析和已知Topo抑制剂的研究发现,anti-ASFV药物可以最终抵消ASFV病毒拓扑异构酶的活性。2.3ASFV转录pQP509L 是 ASFV 表达的 RNA 解旋酶,感染ASFV 病 毒 12 h 后,在 宿 主 细 胞 核 内 检 测 到pQP509L,其可能参与晚期病毒转录本的终止和释放,删除QP509L和QP383R基因会导致ASFV复制能力或毒力被高度减弱11。因此,对pQP509L结构和功能的研究有望更深入了解这些蛋白,并对ASFV疫苗的设计和应对新出现的ASFV毒株至关重要。2.4ASFV转录后修饰pN
11、P868R是由1个N端三磷酸酶(TPase)结构域、1个中心鸟苷转移酶(GTase)结构域和1个C端甲基转移酶(MTase)结构域构成的蛋白。pNP868R参与mRNA5端加帽过程,有助于mRNA的稳定性72养殖与饲料 2024 年第 4 期和高效翻译12,对pNP868R底物识别和催化作用的分析有望为有效的生物靶向ASFV相关酶的发展提供1个方向。2.5ASFV翻译g5Rp 是唯一的病毒 mRNA 脱帽酶,病毒感染早期在内质网表达,并在ASFV感染过程中积累,该酶在 mRNA 调控和翻译起始起着重要的作用13。g5Rp具有广泛的核苷酸底物特异性,能够与鸟嘌呤、腺嘌呤核苷酸和二核苷酸多磷酸等多
12、种底物结合,从而抑制g5Rp的mRNA脱帽活性。当g5Rp与宿主细胞的 RNA结合后,它能稳定地切割附着于Nudix基序的RNA部分上的mRNA5帽子,从而抑制病毒的表达。虽然g5Rp的晶体结构已经确定,但g5Rp与mRNA相互作用形成的复杂结构尚不清楚8。因此,对g5Rp蛋白酶活性结构基础的进一步研究,可能对 ASFV 新药和疫苗的开发有深远的意义。pI215L定位于病毒表面和宿主细胞核,pI215L基因能够编码E2-泛素偶联酶(UBCv1)。UBCv1具有较高的活性,与40S核糖体蛋白S23(RPS23)相互作用。UBCv1还能够与真核起始因子4E(eIF4E)结合,并诱导该因子过表达,从
13、而导致蛋白质合成增加14。此外,UBCv1在调节 TSC2和 mTOR信号传导和降解 4E-BP2 真核翻译起始因子中起重要作用15。进一步研究pI215L的结构和功能,有助于研发抗ASF药物。2.6ASFV组装p72是免疫系统识别ASFV的关键保护抗原之一,也是 ASFV主要衣壳蛋白。p72占病毒颗粒总质量33%左右,同时p72是在病毒感染猪血液中能被检测到的主要抗原16。p72 也有 1 个分子伴侣pB602L,可以促进 p72 的正确折叠,在 pB602L 缺失的情况下,病毒的组装过程被严重改变,产生了异常的“拉链状”结构,而不是二十面体的病毒颗粒。此 外,抑 制 pB602L 的 合
14、成 会 影 响 多 蛋 白pp220和pp62的蛋白水解过程,从而降低p72的表达水平17。p72作为主要的衣壳蛋白,构成了大部分的外衣壳,是 ASFV的关键免疫保护抗原之一。对 p72结构的分析将为未来抗原表位疫苗的设计提供新的参考。H240R是 ASFV的衣壳蛋白,是 1种未确定特征但必需的病毒粒子蛋白,具有单一的果冻卷和球状帽,H240R被1个p72壳包裹,填充五聚体衣壳,形成1个顶端,促进整个衣壳的组装。H240R、p17、p49和M1249L在衣壳外壳下方形成1个复杂的网络,稳定了整个衣壳17。p17由D117L基因编码的定位于衣壳和内脂质包膜的主要结构跨膜蛋白,p17是衣壳和二十面
15、体形态发生组装所必需的1种必要且高度丰富的蛋白质18。p17 与 p72 的碱基结构域密切相关,可以将p72衣壳牢固地固定在内膜上,确保衣壳的稳定17。Zheng等19研究表明,p17被证明通过内质网应激和ROS介导的细胞周期阻滞来抑制细胞增殖,这表明p17参与了ASF的发病机制。Xia等证实20,p17也可能通过与 STING 的相互作用和干扰 TBK1 和IKK 的募集来抑制 cGAS-STING 通路,从而抑制IFN反应,促使免疫逃避。p49由ASFV B438L基因编码的蛋白,与p72形成外衣壳,靠近衣壳顶点,是衣壳顶点形成的1个重要组成成分。P49与膜结合,在膜上介导核复合体与内膜对
16、接,招募荚体形成戊核,从而启动病毒组装21。3ASF疫苗研究进展3.1灭活疫苗病毒灭活疫苗的优点是具有更高的安全性,然而采用传统方法灭活并不一定能转化为产生保护性免疫的疫苗,也会产生抗体应答。Cadenas-Fernndez等22通过传统方法用多种灭活的ASF抗原对猪进行免疫,结果发现尽管在某些情况下能够诱导血清学免疫反应,但最终没有产生足够的保护。因为细胞免疫似乎对保护至关重要,而在原发感染中很难实现有效的病毒中和。肯尼亚国际牲畜研究所(ILRI)与科罗拉多州立大学(CSU)合作的研究人员现在尝试使用1种Mirasol工艺的新方法开发灭活疫苗,将ASF病毒样本与核黄素(维生素B2)混合,然后
17、用特定量的紫外线进行处理,分解病毒中的核酸,导致病毒失去复制能力,有望制备ASF疫苗,但后续进展还有待研究。73养殖与饲料 2024 年第 4 期3.2亚单位疫苗亚单位疫苗使用纯化的重组蛋白或合成肽,其包含能够诱导保护性免疫反应的特异性病毒表位。研究者针对亚单位和DNA疫苗的主要靶点结构蛋白p54、p30、p72和血凝素CD2v,进行评估ASFV抗原的保护潜力试验。使用杆状病毒表达的重组p54和p30进行初步疫苗接种试验,对攻毒具有不同程度的保护作用。在同一系统中表达的嵌合p54/p30也取得了一些成功,从而产生了中和抗体,并在毒力病毒的攻击中存活下来23。然而,在另一项研究中,杆状病毒表达的
18、p54、p30和p72的组合未能诱导对攻毒的保护24。杆状病毒表达的CD2v也表现出一定程度的保护作用,但这种保护作用是在缺乏中和抗体的情况下诱导的25。3.3DNA疫苗研究26发现,对编码p54/p30融合蛋白的DNA疫苗未能诱导保护,既不产生中性抗体,也不产生T细胞反应,将编码CD2v细胞外可溶性结构域的基因片段与p54/p30嵌合体融合,以复制先前观察到的保护作用,诱导了体液和细胞反应,但最终没有成功。然而,泛素与3种ASFV决定簇的融合诱导了强烈的CD8+T细胞反应,并在缺乏特异性抗体的情况下提供了部分保护25。这表明这些抗原虽然是必要的,但可能不足以起到保护作用。3.4病毒载体疫苗腺
19、病毒、病毒和痘病毒载体呈递的多达47种不同ASFV基因的抗原混合物能够诱导强烈的抗原特异性细胞反应27。1 项研究报告称,1 个由 8 种ASFV 基因组成的库,包括 B646L(p72)、CP204L(p30)、CP530R(pp62)、MGF 110-4L 和 110-5,由复制缺陷型人腺病毒5原代和改良牛痘安卡拉疫苗增效剂储存,导致一定比例的猪在感染OUR T88/1分离株后,临床症状减缓,病毒血症水平降低。对其免疫方案进行的后续研究表明,其在用OUR T88/1毒株攻毒的猪群中实现了 100%的致命疾病保护28。2023年8月,中国科学院广州生物医药与健康研究院和广州实验室等构建了携带
20、优化设计的多抗原组合的腺病毒载体非洲猪瘟疫苗,结果显示其可为田间猪群提供保护29。3.5减毒活疫苗减 毒 活 疫 苗(live attenuated vaccines,LAV)ASF-LAV的生产采用了3种主要策略:通过细胞传代进行衰减,筛选自然减毒菌株以及删除毒力相关基因30。1)基因型毒力ASFV菌株在猪骨髓和肾细胞中的连续传代导致了细胞传代的衰减,用减毒菌株免疫的猪对强毒株有保护作用,然而后续会发展成慢性 ASF。Balysheva等31在基因型菌株上通过在猪淋巴细胞杂交细胞系 A4C2/9k和非洲绿猴肾细胞系CV-1中传代来减弱Stavropol 01/08菌株,尽管由此产生的病毒失去
21、了致病性,但它们未能保护猪免受毒性攻击。2)筛选在ASF流行期间自然发生的自然减毒的非血液吸附(非 HAD)菌株和/或毒力降低的菌株,如在慢性感染的猪和软蜱中分离的非HAD基因型I菌株和从野猪中分离的基因型菌株,用这些菌株免疫的猪受到同源强毒株攻击的保护,在某些情况下显示出对异源病毒的部分交叉保护,保护水平在66%100%。尽管这些自然减毒菌株有可能发展成为LAV,但可能有残留毒力,因为 35%45%接种过疫苗的猪,至少在一定剂量下会出现不可接受的接种反应32。3)删 除 毒 力 相 关 基 因 或 通 过 同 源 重 组 或CRISPR/Cas9基因编辑逃避免疫应答的基因,以提高自然减毒毒株
22、的安全性和循环强毒毒株的衰减,对目前ASF-LAV的研究至关重要33-34。迄今为止,最有潜力的LAV候选株是ASFV-G-I177L菌株,它可以通过肌内和口鼻途径给药,诱导强大的无菌免疫35,并在针对 TTKN/ASFV/DN/2019 的后续试验中被证明是有效的,越南基于ASFV-G-I177L原型的商业疫苗测试已经完成36,越南农业农村部(MARD)和美国农业部合作开发了 3种以 ASFV-G-I177L 为主要缺失的多种基因缺失模式的基因缺失疫苗,AVAC、DABACO 和NAVETCO 三大公司分别采用细胞系(DMAC)、PAM/PIPEC细胞和PAM细胞3种不同的制造方式生产疫苗。
23、BA71CD2,除了能给基因型和病毒提供固体保护外,还具有能够在商业COS-1细胞74养殖与饲料 2024 年第 4 期系中稳定生长而无需先前适应的额外优势37。基因型自然减毒菌株Lv17/WB/Rie1在野猪中表现出坚实的保护作用,并在家猪中诱导100%的保护作用以分别具有最小和无临床症状的毒力攻击,基因型自然减毒菌株NH/P68适应于细胞系,该细胞系已证明对基因型强毒病毒的副作用显著减少和100%保护38。ASF各种疫苗的优劣及研究进展见表1。4结 语目前,ASF已在我国定植,只有实施有效和安全的高质量疫苗才能确保减少ASF的传播。ASFV基因组大、结构复杂、很多基因功能未知,且受基因型多
24、、研究条件限制、感染与免疫、致病等分子机制不清等多方面因素影响,ASF疫苗研发难度大。解析ASFV蛋白的结构和功能将有助于更清楚地了解病毒与宿主之间的相互作用,以及ASFV的复制和传播机制,将有助于筛选保护性抗原,并设计更有针对性和更有效的ASF疫苗。加快疫苗研发是未来预防和控制非洲猪瘟的基本策略,未来对ASF病毒学和功能基因组学的研究将集中在其蛋白质结构和功能、感染和免疫机制、增强免疫保护的疫苗靶点以及在靶动物上进行测试、评估疫苗安全性和免疫效果等方面。今后,应加强ASFV全基因组水平监测,这有利于掌握ASFV的流行趋势,研究疾病演变,筛选出理想的候选疫苗。杜绝使用不合规和劣质的ASF疫苗,
25、因为其无法对猪只提供保护,并有可能传播导致急性或慢性疾病的疫苗病毒。此外,这些疫苗病毒还可能与田间菌株重组,产生新的菌株逃避检测,并导致急性、慢性和持续的ASFV感染。总之,在研制出有效的疫苗之前,生物安全可能是抵抗ASF传播最行之有效的手段之一。参 考 文 献1ZHANG H,ZHAO S,ZHANG H,et al.Vaccines for African swine fever:an updateJ/OL.Frontiers in microbiology,2023,14:11394942023-12-03.https:/doi.org/10.3389/fmicb.2023.113949
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 非洲 猪瘟 病毒 蛋白 结构 疫苗 研究进展
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【自信****多点】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【自信****多点】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。