细胞培养基的生产和过程控制.doc

细胞培养基的生产和过程控制细胞培养基作为生物制品生产的重要原材料之一，其质量对生物制品有重要的影响。细胞培养基的生产工艺和细胞培养基的原材料选用、生产过程及检验过程中的质量控制对于细胞培养基的产品质量具有直接影响。其中原材料的成份及其质量直接决定了细胞培养基产品的质量及安全性，选择合适的物料是实现细胞培养基功能过程中需要解决的基础问题。生产工艺的选择（如原料的研碎、混合技术等）及生产过程中的质量控制等直接影响产品的溶解性、批生产量及批次间差异，进而影响产品的质量。cGMP稽查员在对国内细胞培养基生产企业进行cGMP审计时指出，细胞培养基的生产工艺及设备应经过验证，原材料必须做鉴别试验，记录应真实反映生产过程的实际情况，生产过程偏差处理应包括对出现偏差之前涉及到的批次均应进行调查等等。这些要求是基于FDA对生物制药用原料的质量要求方面提出，远远高于国内对药用原料的要求。随着对人用和动物保健用生物制品安全性要求的提高，严格执行GMP规范进行细胞培养基生产是国内细胞培养基行业发展的必然趋势。1.1细胞培养基的原料选择及质量控制1.1.2原材料的原料选择由于动物细胞培养基产品属于药用原料，哺乳类动物细胞培养基行业标准对细胞培养基产品的微生物限度、内毒素含量进行了限定，所以细胞培养基所用原料宜采用注射级、药用级原料。对于部份没有注射级和药用级的原料，细胞培养基制造者针对自身产品质量要求，制定一些重要指标（微生物限度、内毒素、重金属等）进行原材料的质量控制。1.1.2原材料的质量控制细胞培养基生产企业建立完善的原材料质量标准，对于原材料的来源、检验、使用、及销毁等有明确的可追溯记录。在质量控制过程中，药用级原材料的质量标准应参考中国药典相关标准，对于非药用级原材料应根据生产工艺需要与供应商一起共同确定质量标准，质量标准应包括如下内容：指定的物料名称和企业内部使用的物料代码、药典专论的名称（如有）、 经批准的供应商以及原始生产商、印刷包装材料的样张、物料质量标准依据及其编号、取样、检验方法或相关规程编号、定性和定量的限度要求、贮存条件和注意事项、复验前的最长贮存期。原材料的质量检测主要从材料、人员、方法三个方面进行控制：1) 具有必要的检测试剂、设备和设施，如鲎试剂、分析天平、洁净操作室或取样柜。2) 拥有相应操作资质和能力的检验人员，如相应检测人员应具备化验员资质并经过全面的技能培训。选择具有法律效力的检测方法以及对应的操作规范，在检测方法的选择方面药用原料应优先采用药典方法，非药用原料应采用经过验证有效的检测方法，在确定检测方法后应制定相应标准操作文件，用于规范试验操作。应严格控制细胞培养基的原材料质量管理，并建立相应完善的原材料质量管理文件体系。原材料的质量管理方面，应明确规定责任范围和流程方法，它们是保证原材料质量的基础。原材料质量管理文件体系内容通常包括两个方面，一方面是明确原材料质量责任应归属的部门及人员，以实现分工明确；另一方面是明确原材料的取样、检验、放行、判定不合格、异常情况、偏差、验证等事务具体流程，确保流程正确，方法无误，为质量控制提供依据。1.2细胞培养基生产生产工艺传统的细胞培养基生产工艺即生产过程通常分为物料配比、物料干燥、物料研碎、物料混合、物料包装、成品的检验等6个阶段，下面结合过程中的质量控制对此工艺进行介绍：1.2.1物料配比物料配比是根据配方要求将各种原料按比例配制的过程。配制需严格执行配方，才能保证细胞培养基产品功能的实现及降低批间差，而实现低误差的物料配比过程需从以下几个方面进行控制：1) 提供与生产工艺规程匹配且经过审核的、有效力的物料配方，生产部门根据配方制定配比操作记录，经质量管理部门审核后，方可投入生产作业使用；2) 具有详细明确的经过验证的设备、设施、工序操作规程以及相关管理规程，如通过编制设备、设施的验证、使用、维护、维修操作规程来明确操作方法和流程，通过编制相应管理文件，来明确人员责任；3) 具有足够的在校验有效期内的精确度合理的计量器具，及与产品质量要求相匹配的生产环境设施，如为降低细胞培养基微生物、内毒素限度使用洁净厂房进行生产等；4) 足够的经过合理培训具有上岗资质的操作人员和设备管理人员（操作员上岗证、计量员证），各岗位操作人员配备足够，能够确保操作过程实现双人操作双人复核；5) 配备足够的基层管理人员以及现场QA，起到指导和监督作用。1.2.2物料干燥基于细胞培养基产品营养丰富，且不是无菌制剂的特性，为避免微生物滋生破坏细胞培养基成份，需控制细胞培养基中的水分含量，依据行业标准要求，其干燥减重质量分数应低于5.0%，而原料干燥是控制其含水量的最重要环节。目前常用的干燥方法有常压干燥和冷冻干燥。常压干燥包括烘干干燥、鼓式干燥、带式干燥，由于国内细胞培养基生产厂家普遍采用球磨缸进行生产，由于各缸独立，无法使用鼓式干燥、带式干燥的方式进行连续烘干作业，所以普遍采用烘干干燥的方式按批进行物料干燥。冷冻干燥主要用于不能耐受高温的贵细物料的干燥处理。1.2.3物料研磨细胞培养基颗粒越细，同质条件下比表面积越大，其溶解性越好，而其成品细度是由物料的研磨过程直接决定。对于物料的研磨，传统普遍采用药用球磨机，其主要优点是结构简单、操作方便、易于清洁及使物料混合作用（能够实现缸体内各种成份的均匀分布）。球磨缸内的研磨球材质通常有陶瓷、玛瑙、不锈钢（304或316L）。但是球磨机也存在批量小、噪音大、难以控制温度、粉状物料不易取出且取料过程会产生大量粉尘等缺点。目前国内一些细胞培养基生产企业在球磨缸取料工序装备了全密闭自动取粉装置，较好的解决了粉尘污染问题，也进一步降低了由于物料的裸露可能带来的引入异物及物料受潮的风险。1.2.4物料混合混合设备首先必须具备能够实现物料均匀性的功能。在上述物料研磨过程中，可能存在投料微量误差、过程参数细微差异以及其他不可控因素，上述因素的累积会导致不同研磨单元内物料可能出现一定的差异（外观、理化性质、培养性能），这些差异将直接影响产品的使用，造成使用者生产效率及产品的批间差异。根据哺乳类细胞培养基行业标准中对于“批”的定义，即同一台混合设备一次混合量所生产的均质产品为一批，物料经研磨单元研磨以后必须进行总混和均匀后才能称为一批成品进行包装。目前常用的物料混合设备以掺和机、双锥混合机较为常见。1.2.5物料包装物料的包装分为内包装和外包装，主要为了实现如下功能：1) 阻隔性功能：即密闭保存（避光、防潮、防污染、防氧化等），是指直接与产品接触的内包装，在选择内包装材料时其阻隔性是关键，高阻隔性包装薄膜所采用的阻隔性树脂主要有EVOH、PA、PET、PVDC、PC、MXD6和聚丙烯腈共聚物，其中PVDC是开发较早的阻隔性能优异的材料，而包装用薄膜材料结构包括：纸塑料、塑料镀铝塑料、纸铝箔塑料和塑料铝箔塑料等几种【11】；2) 产品信息的提供：产品外包装上应明确标识品名、批号、代码、生产日期、有效期、使用方法等基础信息，并随附企业质量监管部门下发的产品合格证以及质量检验报告等质量证明文件；3) 易于运输的防护：确保外包装物能够抵御运输过程中装卸产生撞击的冲击，并要具备一定的堆叠强度，对于需要远途运输的不能耐受高温的成品应做好低温保护工作（填充保温材料，包装箱内混装冰袋、干冰等蓄冷物）。1.2.6成品的检验细胞培养基产品生产完毕后，由质量检测部门对该批次产品进行检测，在这一周期内，成品处于待验状态，储存条件应与合格成品一致，应专区存放专人管理，避免混淆和遗漏，在收到质量检测部门检测合格予以放行的通知后，转交成品库，移入合格品区备售。1.2.7细胞培养基生产的新工艺采用上述传统的生产工艺（通常称作球磨工艺）生产的产品均一性较好，物化性能稳定以及细胞培养效果较好，但是存在批量小、研磨过程中的散热难以控制、噪音及粉尘污染较大等缺点。2005年新开发了一种连续生产的针式研磨系统（pin mill），集“物料混合针式研磨研磨后混合”一体，用于工业化生产干粉细胞培养基，可以用来生产从10kg至4000kg不等批量的干粉细胞培养基。Pin mill研磨系统是一种高速冲击研磨系统，包括一个进料口、两个同轴带有研磨针的转盘以及一个出料口。当原料通过进料口投入研磨器后到达转盘中央，在转盘旋转离心力的推动下往径向外侧运动同时被相互咬合且相对旋转运动的研磨针研细。物料在进入针式研磨腔前和完成研磨离开研磨设备后都使用混合机进行了混合，以确保进入研磨器和最终产品的成份均匀性，其生产工艺流程见下图4-1。与传统的球磨生产工艺相比，pin mill 生产系统研磨的颗粒更细，批次控制范围大且灵活（0.54000kg），在研磨及研磨后颗粒输送的过程中，采用氮气控制机体的温度，使研磨机的温度保持在40以下，并且避免了粉尘污染、交叉污染等。该系统机体的拆分、组装及清洁也较为简单，适合cGMP生产。关于使用pin mill 系统生产的DPM性能，如生产过程中的成份组成均质性、生产的产品性能及是否适合细胞培养和生物制品生产等，有详细的验证研究，结果显示，pin mill生产工艺生产的产品均匀分布性满足标准，并且均匀性与成份以及批量大小无关；生产的产品诸如溶解性、pH、渗透压等理化性质、细胞培养方面及生物制品生产与球磨生产工艺相同2细胞培养基的质量标准和检测方法2.1哺乳类动物细胞培养基行业标准介绍国内细胞培养基使用者一般采用经验法或实验法选择培养基，但是这些经验或是来自于以前的传统方法、或是通过简单的细胞培养实验，因其影响因素较多，在判定的过程中，不同的使用者判定的标准也不相同，进而可能影响对产品的正确选择。因此，采用统一的质量管理规范是控制产品质量的一个基本前提，2007年10月1日国家发展和改革委员会批准的哺乳类动物细胞培养基（HG/T3935-2007）国家化工行业标准正式实施，为国内动物细胞培养基产品质量及检测方法提供了统一的标准，该标准对哺乳类动物细胞培养基的检测项目和方法做出了明确的规定。2.2细胞培养基的检测方法2.2.1澄清度检查法该方法依据中国药典2010版二部附录IX B 澄清度检查法制定。澄清度是检查药品溶液的浑浊程度，即浊度，药品溶液中如存在细微颗粒，当直射光通过溶液时，可产生光散射和光吸收的现象，致使溶液微显浑浊，所以澄清度可在一定程度上反映药品的质量和生产工艺水平。水是培养基的溶剂，细胞培养基中的营养成份只有完全溶解于水才能被细胞吸收摄取，细胞才能生长增殖，因此培养基是否溶解以及培养液是否透明澄清直接影响培养基使用。通过对水溶解后的培养基的澄清度检查，判断细胞培养基的溶解性。此法是用规定级号的浊度标准溶液与供试品溶液比较，以判定细胞培养液的澄清度或其浑浊程度。2.2.2 pH 值测定法各种细胞的正常功能及一切生物化学反应，都是在适当和稳定的酸碱环境下进行的，因此细胞培养基的pH值是细胞生长的重要参数，pH值偏低或偏高都会影响细胞生长。该法依据中国药典2010年版二部附录 H pH值的测定法进行。由于各酸度计的精度与操作方法有所不同，应严格按各仪器说明书与注意事项进行操作，并在使用之前注意校正。在工业化使用时，由于传统的细胞培养基中含有pH指示剂如酚红等，通常依据“眼睛”观察培养液颜色来判定pH，或是简单的使用pH试纸测定，但是上述方法存在较大的主观因素，影响正确判定，并且在配制的过程中，不同区域还可能存在一定的水质区别等，采用pH仪器检测可以消除人的主观因素，准确性高。此外，在检测过程中，添加碳酸氢钠后的培养基在测定的过程中，暴露在空气中的时间也会对所测pH的准确性有一定的影响。2.2.3干燥减量测定方法细胞培养基具有吸湿性，在空气中放置时水份会很快升高，干燥减量表示产品中的含湿量。细胞培养基是有菌制剂，其丰富的营养成份有利于微生物生长，保持培养基中的低水份含量可以防止微生物的繁殖。检测细胞培养基中水份的含量采用的方法是干燥减量法。该测定方法是依据中国药典2010年版二部附录 L 干燥失重测定法制定，具体是指产品在规定条件下干燥后所减失重量的百分率。减失的重量主要是水分、结晶水及其他挥发性物质等。由减失的重量和取样量计算供试品的干燥失重。2.2.4渗透压通常动物细胞必须生活在等渗环境中，借助K、Na维持渗透平衡。虽然大多数细胞对渗透压具有有一定的耐受性，但是培养液渗透压过高容易使细胞脱水萎缩，培养液渗透压过低容易使细胞膨胀破裂，控制培养基的渗透压范围对于细胞培养具有重要的作用。检测通常采用冰点渗透压仪进行，当供试品溶液的毫渗透压摩尔浓度太大或大于仪器的测定范围时，用适宜的溶剂稀释至可测定的毫渗透压摩尔浓度范围。2.2.5细菌内毒素检测方法细菌内毒素是许多病原性细菌所产生的毒素。细胞培养基中细菌内毒素过高，对生物制品的质量如纯度、引起副反应等方面有影响，而且会降低生物制品的产率。细菌内毒素检查法通常利用鲎试剂来检测或量化由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。其检查包括凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。通常当测的结果有争议时，以凝胶法结果为准。2.2.6微生物限度细胞培养基不是无菌产品，其中的微生物在一定条件下会吸收培养基中的营养物质滋生繁殖，导致培养基变质失效。控制细胞培养基中细菌和霉菌，是延长培养基有效期的方法之一，也是对生产企业的产品、原料、辅料、设备器具、工艺流程、生产环境和操作者的卫生状况进行卫生学评价的综合依据之一，对其的检测是非常必要的。检测方法依据中国药典2010年版附录 J 微生物限度检查法进行，检查项目为细菌数、霉菌数。2.2.7细胞生长试验细胞在体外进行培养时，失去了机体的调节和控制作用，因此，细胞培养液除满足细胞的营养要求外，还必须使其生存环境接近活体的环境。其中培养液及外环境的培养条件如温度、渗透压、酸碱度等均能影响细胞的生长。细胞培养基的功能就是满足细胞体外生长增殖需求，因此细胞培养效果的检验是产品质量优劣的一个直观表述，是必检项目，这也是一个产品性能特性表述的要求。细胞培养检测方法是：细胞在37恒温条件下，在含体积分数为3%10小牛血清的细胞培养液中生长72h，观察细胞形态并进行细胞计数；细胞生长72h后，更换不含小牛血清的细胞培养液，继续培养48h，观察细胞形态并进行细胞计数。培养过程中加血清培养主要检测培养基的培养质量，不加血清培养主要检测培养基的有无毒害物质。细胞生长实验不但在使用一个新的产品时是必须进行的检测项目，在更换不同批次时，为检测是否有批间差也必须进行；此外，即使是同一个批次，分次购买时，或是存放搁置较长时间再次使用时，也需进行该项目检测，以防止培养基在贮存、运输过程中可能发生的质量变化。该行业标准中的检测项目为生物制品厂家控制原材料质量提供一定的依据，但是随着生物制品安全性要求的提高，其所检内容还有待完善，如添加一些诸如动物蛋白、抗生素等的检测，为生物制品厂家控制原材料的安全性提供更高的保障。2.3细胞培养基安全技术说明（MSDS）MSDS是化学品安全技术说明书，是化学品生产或销售企业按法律要求向客户提供的有关化学品特征的一份综合性法律文件。化学品安全说明书作为传递产品安全信息的最基础的技术文件，其主要作用体现在：1) 提供有关化学品的危害信息，保护化学产品使用者2) 确保安全操作，为制订危险化学品安全操作规程提供技术信息3) 提供有助于紧急救助和事故应急处理的技术信息4) 指导化学品的安全生产、安全流通和安全使用5) 是化学品登记管理的重要基础和信息来源随着世界各国对产品安全和环境保护的日益重视，无论在国际贸易还是国内贸易中，只要企业生产的产品涉及到化学物质，都必须为客户提供准确的MSDS化学品安全说明书。如果供应商提供的MSDS存在错误或失实，或故意隐瞒有害信息，造成用户的人员伤亡或环境污染，用户往往要求MSDS的提供单位承担相应的法律责任。因此，编制MSDS必须符合买方所在国家和地区的有关危险化学品的法律法规。中国于2000年颁布了国家标准化学品安全技术说明书编写规定（GB16483-2000），用于规范国内化学品生产企业编写化学品安全技术说明书的内容和编写要求，该内容主要包含16项：化学品及企业标识、成分/组成信息、危险性概述、急救措施、消防措施、泄露应急处理、操作处置与储存、接触控制/个体防护、理化特性、稳定性和反应性、毒理学资料、生态学资料、废弃处置、运输信息、法规信息、及其他信息（参考文献、填表时间、填表部门、数据审核单位）等；每项下面有详细的说明，不同的化学品制造者据此结合产品特性制定相应的条款。哺乳类动物细胞培养基是一种由无机盐、氨基酸、维生素以及其他有机化合物按一定比例组成的混合物，在贸易中属于化学品范畴，并且每个品种中的成份及含量不同，针对每个品种都应制定相应的MSDS说明。国外的生物制药企业在对细胞培养基生产企业进行质量审计时，都要求生产企业提供所使用细胞培养基品种的MSDS，经审计符合对方法律要求才有资格作为供应商。而国内生物制品厂家目前尚未对细胞培养基厂家提出该要求。