胶原蛋白的提取及其纳米纤维的制备与表征.pdf
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1、韩洪帅,宋秘钊,李家鑫,等.胶原蛋白的提取及其纳米纤维的制备与表征 J.食品工业科技,2023,44(19):182190.doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022100267HAN Hongshuai,SONG Mizhao,LI Jiaxin,et al.Extraction of Collagen and Preparation and Characterization of NanofibersJ.Science and Technology of Food Industry,2023,44(19):182190.(in Chinese with Englis
2、h abstract).doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022100267 工艺技术 胶原蛋白的提取及其纳米纤维的制备与表征胶原蛋白的提取及其纳米纤维的制备与表征韩洪帅1,宋秘钊1,2,*,李家鑫1,姚丹丹1,王彦珍1(1.齐齐哈尔大学轻工与纺织学院,黑龙江齐齐哈尔 161006;2.齐齐哈尔大学寒区麻及制品教育部工程研究中心,黑龙江齐齐哈尔 161006)摘要:为提高羊皮中胶原蛋白的提取率和利用率,采用酸酶复合法提取羊皮胶原蛋白,再利用静电纺技术制备胶原基纳米纤维。以羊皮胶原蛋白提取率为评价指标,考察料液比、乙酸浓度、胃蛋白酶浓度和酶解时间四个因素对羊皮胶原蛋白提
3、取效果的影响,确定单因素最优水平;在此基础上,采用正交试验设计对羊皮胶原蛋白提取的工艺条件进行优化,并通过紫外光谱扫描、红外光谱扫描、SDS-PAGE 图谱和扫描电镜等生化技术探讨酶解过程对胶原蛋白结构性质的影响;然后将胶原蛋白和聚乳酸复合静电纺丝,制备得到胶原基纳米纤维。结果表明,酸酶复合法提取羊皮胶原蛋白最佳工艺为:料液比 1:25 g/mL、乙酸浓度 1.2 mol/L、胃蛋白酶用量 1.0%、酶解时间72 h,在此条件下羊皮胶原蛋白提取率为 38.42%0.49%;紫外光谱扫描显示羊皮胶原蛋白于 230 nm 附近出现最大紫外吸收峰;红外光谱扫描、SDS-PAGE 图谱分析表明羊皮胶原
4、蛋白主要有 1、2、三种亚基成分组成,属于型胶原蛋白,且胶原蛋白的空间结构保留完整;扫描电镜直观表明了羊皮胶原蛋白的纤维网络结构保留较完整;静电纺丝得到的胶原基纳米纤维直径为 418.02183.77 nm,拉伸强度为 3.6160.386 MPa,断裂伸长率为8.69%1.95%,物理性能优良,有做细胞支架的潜力。本研究为提高羊皮和羊皮胶原蛋白的高值化利用提供了一定的理论基础,也为胶原基纳米医用纤维产品开发提供理论支撑。关键词:胶原蛋白,静电纺丝,共混改性,医用材料,支架本文网刊:中图分类号:TS251.9 文献标识码:B 文章编号:10020306(2023)19018209DOI:10.
5、13386/j.issn1002-0306.2022100267ExtractionofCollagenandPreparationandCharacterizationofNanofibersHANHongshuai1,SONGMizhao1,2,*,LIJiaxin1,YAODandan1,WANGYanzhen1(1.College of Light Industry and Textiles,Qiqihar University,Qiqihar 161006,China;2.Engineering Research Center for Hemp and Product in Cold
6、 Region of Ministry of Education,Qiqihar University,Qiqihar 161006,China)Abstract:In order to improve the extraction rate and utilization rate of collagen in sheepskin,sheepskin collagen wasextracted by acid enzyme compounding method,and collagen-based nanofibers were prepared by electrospinningtech
7、nology.Taking the extraction rate of sheepskin collagen as the evaluation index,the effects of four factors,namelymaterial-liquid ratio,acetic acid concentration,pepsin concentration and enzymatic hydrolysis time,on the extraction effectof sheepskin collagen were investigated,and the optimal level o
8、f single factors were determined.On this basis,the processconditions of sheepskin collagen extraction were optimized by orthogonal experimental design.The effects of enzymatichydrolysis on the structural properties of collagen were explored by biochemical techniques such as ultraviolet spectrumscann
9、ing,infrared spectrum scanning,SDS-PAGE mapping and scanning electron microscopy.Collagen and polylactic acidwere then compounded and electrospun to obtain collagen-based nanofibers.The results showed that the best process forextracting sheepskin collagen by acid enzyme compounding method was as fol
10、lows:Material-liquid ratio of 1:25 g/mL,收稿日期:20221028 基金项目:黑龙江省教育厅项目(135509129);齐齐哈尔大学研究生创新科研项目(YJSCX202010);黑龙江省高教强省产业化引导资金项目(150112222011);黑龙江省省教育厅基本科研业务费(130212222125)。作者简介:韩洪帅(1996),男,硕士研究生,研究方向:蛋白基复合材料的制备及其性能研究,E-mail:。*通信作者:宋秘钊(1969),男,博士,教授,研究方向:蛋白基复合材料的研究,E-mail:。第 44 卷 第 19 期食品工业科技Vol.44 No
11、.192023 年 10 月Science and Technology of Food IndustryOct.2023 acetic acid concentration of 1.2 mol/L,pepsin dosage of 1.0%,enzymatic hydrolysis time of 72 h.Under these conditions,the extraction rate of sheepskin collagen was 38.42%0.49%.Ultraviolet spectroscopy showed that sheepskin collagen hada m
12、aximum UV absorption peak around 230 nm.Infrared spectrum scanning and SDS-PAGE map analysis showed thatsheepskin collagen was mainly composed of 1,2 and three subunit components,which belonged to type I collagen,andthe spatial structure of collagen was intact.Scanning electron microscopy showed tha
13、t the fiber network structure ofsheepskin collagen was relatively intact.The collagen-based nanofibers obtained by electrospinning had a diameter of418.02183.77 nm,a tensile strength of 3.6160.386 MPa,and an elongation at break of 8.69%1.95%,which hadexcellent physical properties and the potential t
14、o be used as a cell scaffold.This study would provide a theoretical basis forimproving the high-value utilization of sheepskin and sheepskin collagen,and also provide theoretical support for thedevelopment of collagen-based nanomedical fiber products.Keywords:collagen;electrospinning;blending modifi
15、cation;medical materials;bracket 胶原蛋白,简称胶原,是一种生物大分子,常见的胶原蛋白类型有型、型、型,其中型胶原蛋白主要存在于动物皮、韧带、眼角膜、骨骼和肌腱中,约占全部胶原蛋白含量的 90%;II 型胶原蛋白主要存在于软骨中;III 型胶原蛋白主要存在内脏中12。我国是畜牧业大国,动物皮产量日益增加,而这些动物皮多用于食品、医疗、皮革、服装等领域,在品质、价值方面仍处于弱势35,毛皮利用率低,在生皮加工中会造成大量的浪费和污染。动物皮是制取动物胶原蛋白的主要载体,目前研究主要是从猪皮、牛皮、鱼皮中水解得到动物胶原蛋白,但以羊皮为研究对象的报告很少。我国羊皮资
16、源丰富,每年生产上亿张羊皮,而羊皮主要成分是角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白,古书记载羊皮蛋白外敷具有治疗跌打肿痛的作用,现代研究表明羊皮胶原蛋白具有透气、保暖、吸湿的特点,对关节炎和风湿病人具有较好的疗效6。胶原蛋白的提取方法较多,有酶法、酸法、盐法、碱法、热水法78,其中盐法用于胶原蛋白的分离纯化;碱法会使胶原蛋白变性成有毒物质;热水法容易导致胶原蛋白变性,常用于明胶的制备。酸法和酶法较为常用,因此本文利用酸酶复合法提取羊皮胶原蛋白。纳米纤维是指纤维直径小于 1 m 的纤维,因其具备尺寸效应和表/界面效应而广泛应用于生物医用、食品包装、吸附过滤、传感等领域9。纳米纤维可通过拉伸、模板合成、自组装
17、、静电纺、相分离等方法制得,静电纺丝法相较于其他方法具有成本低廉、生产设备简单、工艺可控等优点,是近年来发展起来的一种加工技术10。随着科技的发展,静电纺丝用原料也趋向多元化,如天然高聚物(纤维素、蛋白质、多糖等)、合成高聚物(聚乙烯醇、聚己内酯、聚乳酸等),其中胶原蛋白作为动物蛋白的一种,是天然的生物大分子材料,而且具有良好的生物相容性、低免疫原性、可降解性,在止血、药物缓释载体、组织工程支架等方面有广泛应用1112。静电纺胶原蛋白纳米纤维兼具纳米纤维的结构特征和胶原蛋白的化学特征,比表面积大、孔隙率高、生物相容性好、含有大量的活性基团、可模拟细胞外基质13,是理想的生物医用材料。但由于胶原
18、蛋白力学性能较弱,致使其在纺丝和应用中受到限制,因此需要将胶原蛋白改性1415。已知聚乳酸天然可再生、易降解、成纤性好,同时具有良好的抗菌性和力学性1617,本文采用物理共混改性,将胶原蛋白和聚乳酸复合纺丝提高胶原纤维力学性能。相较于化学改性,共混改性无毒无污染,细胞亲和性好。近年来,国内外通过提取动物胶原蛋白,再利用静电纺丝法制备复合材料应用到生物医学领域成为热点。本研究采用酸酶复合法提取羊皮中的胶原蛋白,并进行工艺优化和蛋白表征,然后将胶原蛋白与聚乳酸溶于六氟异丙醇中进行静电纺丝,以期制备出纤维形貌均一、成纤效果好的纳米纤维膜,旨在提供具有一定力学性能和生物活性的医用纳米纤维材料,为进一步
19、的细胞试验和胶原蛋白医用产品开发提供支撑。1材料与方法 1.1材料与仪器干羊皮食品级,齐齐哈尔皮革厂;透析袋(Mw=14000)浙江博时医疗器械有限公司;胃蛋白酶(1200 U/g)、四甲基乙二胺、-巯基乙醇分析纯,上海蓝季科技发展有限公司;氯化钠、异丙醇、丙三醇、三氯乙酸化学纯,天津市光复科技发展有限公司;甲醇、乙醇分析纯,天津市天力化学试剂有限公司;十二烷基磺酸钠、丙烯酰胺、N-N 双丙烯酰胺、三羟甲基氨基甲烷电泳级,上海阿拉丁生化科技有限公司;碳酸钠、过硫酸铵、乙酸化学纯,天津市凯通化学试剂有限公司;溴酚蓝、考马斯亮蓝 R-250电泳级,上海创赛科技有限公司;甘氨酸、蛋白 marker电
20、泳级,上海生物生工工程股份有限公司;聚乳酸、六氟异丙醇分析纯,上海麦克林生化科技有限公司。DF-集热式磁力加热搅拌器江苏荣华公司;BS223S 电子天平北京赛多利斯公司;TDL40B 离心机上海安亭公司;PB-10 pH 计北京赛多利斯公司;LGJ-12 冷冻干燥机北京松源华兴公司;Lamda35 紫外分光光度计美国 PE 公司;Spectrum红外光谱仪美国 PE 公司;DYCZ-24DM 电泳仪北京六一公司;FSP-T 高压静电纺丝机天津云帆公司;S-3400 扫描电镜日本日立公司;TH-8100 万能材料试验机济南普创机电有限公司;325-301 测厚第 44 卷 第 19 期韩洪帅,等
21、:胶原蛋白的提取及其纳米纤维的制备与表征 183 计江都市天发试验机械厂;JY-82C 视频接触角测定仪承德鼎盛试验机检测设备有限公司。1.2实验方法 1.2.1 羊皮预处理称取一定质量的干羊皮,浸入浓度为 12%的氯化钠溶液中,4 h 后取出以除去杂质,用蒸馏水冲洗 3 次,滤干后浸入脱脂剂(6%碳酸钠/8%异丙醇混合溶液 1:1)中,24 h 后取出以除去杂蛋白和脂肪18,用蒸馏水重复洗 3 次,自然通风晾干后称重为 W1,待用,试验温度 4。1.2.2 羊皮胶原蛋白的提取已知哺乳类动物胶原蛋白变性温度和胃蛋白酶的最适温度为 3637 19,本文选择 36 作为酶解温度。把预处理过的干羊皮
22、按照料液比 1:25 g/mL 加入蒸馏水,然后加入乙酸至 1.2 mol/L(反应体系中乙酸的浓度)和 1.0%的胃蛋白酶(相对于干羊皮重)溶解羊皮20,在 36 条件下磁力搅拌 72 h,过滤之后离心(离心机转速为3000 r/min,离心时间 30 min,离心温度 4),收集上清液以除去不溶性物质;将上清液装入的透析袋中,密封并放入大烧杯中,加入蒸馏水,磁力搅拌加速透析,在 4 下透析 3 d,每隔 6 h 换一次蒸馏水,最后得到较为透明的乳白色溶液;把胶原蛋白溶液依次装入培养皿中,用保鲜膜包裹并扎眼透气,在冰箱中预冷冻 12 h 后,快速转移到冷冻干燥机中冷冻干燥(预冷冻温度为18,
23、冷冻干燥温度为60),48 h后取出称重为 W2,得到乳白色的海绵状羊皮胶原蛋白2122。胶原蛋白的提取率 R 按如下公式计算:R(%)=W2W1100式中:R 为羊皮胶原蛋白提取率(%);W1为预处理后干羊皮质量(g);W2为冷冻干燥后提取的羊皮胶原蛋白质量(g)。1.2.3 单因素实验设计 1.2.3.1 料液比对羊皮胶原蛋白提取率的影响设置乙酸浓度为 1.1 mol/L、胃蛋白酶浓度为 1.0%、提取时间为 72 h,研究不同料液比(1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35 g/mL)对羊皮胶原蛋白制备效果的影响。1.2.3.2 乙酸浓度对羊皮胶原蛋白提取率的影响设置料
24、液比为 1:25 g/mL、胃蛋白酶浓度为 1.0%、提取时间为 72 h,研究不同乙酸浓度(0.5、0.7、0.9、1.1、1.3、1.5 mol/L)对羊皮胶原蛋白制备效果的影响。1.2.3.3 胃蛋白酶浓度对羊皮胶原蛋白提取率的影响设置料液比为 1:25 g/mL、乙酸浓度为 1.1 mol/L、提取时间为 72 h,研究不同胃蛋白酶浓度(0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%)对羊皮胶原蛋白制备效果的影响。1.2.3.4 提取时间对羊皮胶原蛋白提取率的影响设置料液比为 1:25、乙酸浓度为 1.1 mol/L、胃蛋白酶浓度为 1.0%,研究不同提取时间(24、36、
25、48、60、72、84 h)对羊皮胶原蛋白制备效果的影响。1.2.4 正交试验设计基于单因素实验,选择以料液比(A)、乙酸浓度(B)、胃蛋白酶浓度(C)、提取时间(D)作为正交试验因素,以羊皮胶原蛋白提取率为参考指标,设计四因素四水平正交试验进行分析,正交试验设计见表 1。表 1 正交试验因素水平设计Table 1 Factor level design of orthogonal test水平A料液比(g/mL)B乙酸浓度(mol/L)C胃蛋白酶浓度(%)D提取时间(h)11:210.90.86021:231.00.96631:251.11.07241:271.21.178 1.2.5 胶原
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