鉴别非洲猪瘟病毒基因缺失株与野生株多重qPCR方法的建立.pdf
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1、DOI:10.1网络首发时间:2 0 2 3-0 6-0 52023,53(09):1089-1094中国兽医科学2023,53(09)ChineseVeterinaryScience6656/jissn.1673-4696.2023.0152中图分类号:S852.659.1文献标志码:A文章编号:16 7 3-46 96(2 0 2 3)0 9-10 8 9-0 6鉴别非洲猪瘟病毒基因缺失株与野生株多重qPCR方法的建立卓玛1,2,钱炳旭1,薛峰1,2*,戴建君1,吴晓东3*(1.南京农业大学动物医学院,江苏南京210000;2.南京农业大学三亚研究所,海南三亚572000;3.中国动物卫生
2、与流行病学中心,山东青岛266000)摘要:为开发一种快速、灵敏的非洲猪瘟病毒(ASFV)野生型株与基因缺失型株的鉴别诊断方法,本研究通过对ASFVp72、CD 2 v、M G F110-9L基因保守序列设计特异性引物和探针,并对体系进行优化,建立了一种可以同时检测p72、CD 2 v、M G F110-9L基因的多重qPCR方法。该方法与其他常见猪病毒性病原均无交叉反应,特异性强;敏感性试验结果显示,该方法对p72、CD 2 v 和MGF110-9L重组质粒标准品的最低检出限均为10 2 copies/mL,敏感性好;组内变异系数为0.0 3%0.5%,组间变异系数为0.0 4%1.5%,表
3、明该方法重复性好。利用本方法和普通qPCR方法分别对50 份临床样品进行检测,结果显示,两种检测方法对ASFV核酸的检出率均为7 0%(35/50),符合率为10 0%。综上所述,本研究建立的多重qPCR方法为临床鉴别检测ASFV野毒株与基因缺失株提供了重要材料。关键词:非洲猪瘟病毒;基因缺失型株;p72;MGF110-9L;CD2vEstablishment of multiplex qPCR method for identification of genedeletion strains and wild strains of African swine fever virusZhuom
4、a-2,QIAN Bing-xu,XUE Feng.2*,DAI Jian-jun,WU Xiao-dong*(1.College of Veterinary Medicine,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210000,China;2.Sanya Institute of NanjingAgricultural University,Sanya 572000,China;3.China Animal Health and Epidemiology Center,Qingdao 266000,China)Abstract:To develop
5、a convenient,rapid and sensitive identification technology between ASFV gene deletionstrains and wild-type virus strains,three pairs of specific primers and probes were designed for ASFV p72(B646L)gene,CD2v(Ep402R)gene,and MGF110-9L gene.By optimizing each system,a multiplex qPCR system forsimultane
6、ous identification of p72,CD2v,and MGF110-9L genes was constructed.This methodhas no cross-re-activity with other swine pathogens,Strong specificity;High reproducibility,the sensitivity of thethree target genes of ASFV(p72,MGF110-9L,CD2v)is 10copies/mL;Highlyrepeatable,the intra-groupvari-ationcoeff
7、icient was 0.03%0.5%,and the intergroup variation coefficient was 0.04%1.5%;After ver-ifying 50 clinical samples using the method established in this study and the common qPCR method,the re-sults showed that the detection rate of ASFV by the two methods was 70%(35/50),and the consistency rate of50 p
8、ositive samples was 100%.In summary,the method established in this study provides important mate-rials for the clinical identification of ASFV gene deletion strains and wild-type strains.收稿日期:2 0 2 3-0 2-12;修回日期:2 0 2 3-0 4-12基金项目:国家重点研发计划项目(2 0 2 1YFD1800500,2 0 2 0 YFA 0 910 2 0 0);海南省科技专项(ZDYF202
9、2XDNY248);江苏省农业科技自主创新基金项目 CX(21)2038;三亚市南京农业大学研究院指导基金项目(NAUSY-ZD08)作者简介:卓玛(1998-),女(藏),西藏加查人,硕士生,主要从事人兽共患病预防新技术及其病原学基础方面的研究,E-mail:2 0 2 9398 498 q q.c o m。*通讯作者:薛峰(197 1-),研究员,主要从事人兽共患病预防新技术及其病原学基础方面的研究,E-mail:;吴晓东,研究员,主要从事重大外来动物疫病的综合防控技术研究,E-mail:。1090第53卷中国兽医科学Key words:African swine fever virus;
10、gene deletion strain;p72;MGF110-9L;CD2v*Corresponding authors:XUE Feng,E-mail:;WU Xiao-dong,E-mail:wuxiaodongca-非洲猪瘟(ASF)是一种急性、高度传染性的猪病,猪感染后死亡率高,给全球养猪业带来较大经济损失 1。非洲猪瘟于192 1年在肯尼亚被首次确诊,并于1957 197 2 年传人欧洲、美洲;2 0 0 7 年传人欧亚接壤的格鲁吉亚,随后传入俄罗斯并在高加索地区流行;2 0 12 一2 0 18 年传入乌克兰、白俄罗斯、立陶宛、匈牙利等国家;2 0 18 年8 月以来在我国多地陆
11、续发生非洲猪瘟疫情 2 。非洲猪瘟病毒(ASFV)是一种具有包膜结构的双链DNA(dsDNA)病毒,是Asfarviridae病毒家族里的唯一成员,拥有17 0 194kb的dsDNA基因组 3。虽然ASFV已被发现10 0 多年,但目前仍无安全、有效和完全商业化推广的非洲猪瘟疫苗 4。控制ASF是一项非常重要的任务,关系到一个国家的粮食安全和经济稳定。据报导,目前在疫苗研究中ASFV减毒活疫苗已经被研究者归列为最具有希望的ASFV候选疫苗 5。敲除ASFV的CD2v和MGF这2 个毒力基因可以显著降低ASFV的毒力,免疫猪可部分抵御同血清型ASFV野毒感染 6 ,因此,CD2v和MGF基因缺
12、失株是ASFV减毒活疫苗的重要研究靶点 7 。最近,Ding等 8 研究发现ASFVMGF110-9L的敲除可以有效降低ASFV毒力并能够起到很好的免疫保护效果。据报道,目前在国内流行的非洲猪瘟基因I型病毒缺失株主要为ASFVCN/GS/110分离株与ASFVHLJ/505毒株 9-10 。但是,以ASFVCN/GS/2018分离株MGF110-9L基因作为ASFV野毒株和基因缺失毒株鉴别诊断靶点尚未被研究报道。本研究针对ASFVCN/GS/2018分离株MGF110-9L基因和CD2v(Ep402R)基因缺失部位设计特异性引物和探针,用来鉴别样品中是否缺失相应基因。另外,还筛选出p72保守区
13、作为扩增目标基因,用以区别ASFV与其他病毒。本试验所建立的多重qPCR方法,可实现ASFV野生型与基因缺失型菌株的鉴别,为临床ASFV检测提供了一种重要材料。1材料与方法1.1病毒株、载体和样品ASFVCN/GS/2018分离株、猪细小病毒(PPV)、口蹄疫病毒(FMDV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRR-SV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、塞内卡病毒(SVA)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪delta冠状病毒(PDCoV)、猪2 型圆环病毒(PCV2),pET-28a载体和50 份临床样品均由中国动物卫生流行病学中心提供1.2引物与探针根据ASFVCN/GS/2018分离株序列,采用Bio
14、Edit软件进行核酸序列分析,用SnapeGene在ASFV的3个靶基因(p72、M G F110-9L、CD 2 v)的保守序列处设计特异性引物和探针(表1),合成并纯化。1.3重组质粒标准品的构建与鉴定以ASFV的DNA序列片段作为模板,利用普通PCR扩增相应的目的片段。反应体系:GreenMix12.5L,引物(F、R)各1L,模板2 L,最后用ddH0添加至2 5L。扩增程序:945min,9430s,5230 s,7 2 2 0 s,共35个循环,7 2 10 min。将p72、CD 2 v 和MGF110-9L基因的PCR产物分别进行电泳,并与pClone007载体连接、转化到DH
15、5a中,接种后在氨苄固体培养基上过夜培养,筛选出单个菌落并通过菌液PCR鉴定,送到擎科(南京)生物技术有限公司进行测序,测序正确后命名为pClone007-p72、p Cl o n e 0 0 7-CD 2 v 和pClone007-MGF110-9L。提取质粒,用酶标仪测定质粒浓度,用以统计拷贝数。用去离子水将质粒标准品进行10 X连续稀释,使其终浓度为110 1l110 c o p i e s/m L,一2 0 保存备用。1.4多重qPCR条件的优化及标准曲线的构建引物、探针的浓度优化采用方阵法,确定总体系为 2 5 L,其中 2 XPerfectStart II Probe qPCR S
16、uperMix10L,10mol/L引物F和R分别添加0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 L,10mol/L探针P分别添加0.4、0.5.0.6.0.7.0.8L,模板加人6 L(p Cl o n e 0 0 7-p 7 2、pClone007-CD2v和pClone007-MGF110-9L各加 2L),最后用ddHzO补充至2 5L。利用优化完全的引物和探针,对退火温度进行优化,退火温度分别设置为56、58、6 0、6 2、6 4。将 ASFV pClone007-p72、p Cl o n e 0 0 7-CD 2 v 和pClone007-MGF110-9L重组质粒标准品原液均制备成
17、310 copies/mL,然后按1:1:1混匀后10 稀释,取7 个梯度浓度(10 copies/mL10copies/mL)重组质粒标准品混合液作为模板,按照优化好的体系和条件进行多重qPCR扩增。1.5特异性试验将 ASFVpClone007-p72,pClone007-CD2v和 pClone007-MGF110-9L重组质粒标准品DNA与PPVPRR-1091卓第9 期玛等:鉴别非洲猪瘟病毒基因缺失株与野生株多重qPCR方法的建立表1引物和探针序列Table 1 Primer and probe sequences引物/探针Primers/probes序列(5-3)Sequences
18、报告基团Reportinggroupp72-FGCTGTAATGGACCTCAAACp72-RCGAAGGGAATGGATACTGAGp72-PCCTCTTGCGCTCTGGATTAAGTTGCFAMBHQ2CD2v-FCGCGGATCCGACACCACTTCCATACATGCD2v-RCCCAAGCTTCGAGTGGTTGTGTTGAGGGCD2v-PACCATCTCCCAGAGAACCATTACTTCCTVICBHQ1MGF110-9L-FCCGGAATTCTACCAGAATTACCAAGAACCMGF110-9L-RCCCTCGAGCGATGCCATTTTGACAATCCCAMGF110
19、-9L-PAGCATCCTCCTAAGGAGGAGCTTCCATNEDMGB-NFQp72-WOAH-FCTGCTCATGGTATCAATCTTATCGAp72-WOAH-RGATACCACAAGATC(AG)GCCGTp72-WOAH-PCCACGGGAGGAATACCAACCCAGTGFAMBHQ1SV.PRV.CSFV.PEDV.FMDVPDCoV.PCV2.SVA猪病病原核酸作为模板,以去离子水为阴性对照,按已优化好的多重qPCR进行扩增,以测试该方法的特异性。1.6灵敏度试验分别以10 连续稀释的ASFVpClone007-p72、pClone007-CD2v、p Cl o n e
20、0 0 7-M G F110-9L重组质粒标准品(10 copies/mL10copies/mL)混合液作为模板,以去离子水为阴性对照,进行多重qPCR扩增,以质粒标准品稀释度为横坐标,C值为纵坐标,探究该方法的最低检出限,1.7重复性试验选取3个梯度(10 5copies/mL10 c o p i e s/m L)经10X稀释的pClone007-p72、p Cl o n e 0 0 7-CD 2 v 和pC-lone007-MGF110-9L重组质粒混合液为模板,每个梯度做3次平行试验。经多重qPCR扩增后计算组内、组间变异系数,以验证方法的重复性。1.8临床样品验证将由中国动物卫生流行病
21、学中心提供的50 份临床样品提取病毒DNA后,按照上述优化的多重qPCR方法进行扩增,同时以普通qPCR为对照组,比较两种方法的检测结果和阳性样品的符合率。2结果2.1重组质粒标准品的构建及鉴定以ASFVCN/GS/2018分离株的全基因组序列为模板,利用普通PCR扩增目的片段。结果(图1)显示,扩增后获得与预期大小一致的目的基因片段,依次为p72(158bp)、CD 2 v(12 4b p)和MGF110-9L(156 b p)。将目的片段克隆至pClone007载体,送去擎科(南京)生物技术有限公司测序验证。测序成功后,提取质粒并计算拷贝数。测得重组质粒浓度分别为p72(193ng/L),
22、CD2v(172.4ng/L)和MGF110-9L(200ng/L)。经统计,p72、CD 2 v 和MGF110-9L的拷贝数分别为11.410 copies/mL、13.2 10 c o p-ies/mL,3X10ll copies/mL。2.2多重qPCR体系的优化及标准曲线的建立经优化后,确定总反应体系为2 5L:2 Pe r f e c tStart II Probe qPCR Super Mix 10 L,10 mol/L p72-F和p72-R 各 0.4 L,10 mol/L p72-P 0.2 L,10 mol/L C-D2v-F 和 CD2v-R各 0.4 L,10 mol
23、/L CD2v-P0.3 L,10 mol/L MGF110-9L-F 和MGF110-9-R各 0.3 L,10mol/LMGF110-9L-P0.6 L。p C-l o n e 0 0 7-p 7 2、pClone007-CD2v 和 pClone007-MGF110-9L(1:1:1)混合液模板6 L,最后用ddH,O补充至2 5L。扩增温度为6 0,45个循环时,本研究建立的多重qPCR具有良好的扩增曲线。将 ASFV pClone007-p72、p Cl o n e 0 0 7-CD 2 v、p Cl o-ne007-MGF110-9L重组质粒标准品连续10 倍稀释后作为模板,经多重
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