基-于脂蛋白纳米载体的小干扰rna靶向递送方法研究--本科毕业设计.doc
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1、 基于脂蛋白纳米载体的小干扰RNA靶向递送方法研究摘要RNA干扰作为一种治疗途径尤其是恶性肿瘤的治疗具有巨大潜力。然而,系统递送siRNA需要高效和生物相容性的递送手段。肿瘤细胞通过过度表达清道夫B型1受体类(SR-B1)受体以清除HDL(HDL)粒子来维持其高生长水平。本文利用这种细胞特性来实现高效siRNA递送,通过siRNA偶联重组成HDL(rHDL)纳米粒子建立一种新型的siRNA制剂。这里,我们证实rHDL纳米粒子促进了siRNA体内高效递送。 此外,概念证明治疗研究中,这些纳米粒可以有效沉默两种蛋白的表达,在原位卵巢和结肠直肠癌小鼠模型中,这两种蛋白是癌症生长和转移的关键(信号传感
2、器和转录激活因子3以及粘着斑激酶)。这些数据表明,rHDL纳米粒是一种新型、高效的siRNA载体,因此。这种新型技术可以作为新型癌症治疗方法的基础。 介绍 RNA干扰(RNAi)逐渐被认为是一种潜在,高效的治疗途径。这个概念根源于干扰RNA(例如,小分子干扰RNA)基因沉默的能力,传统治疗方法很难靶向这些基因,如抗体或小分子抑制剂。即使干扰RNA靶向特定基因确实很有前景的,但需要体内高效和生物相容性的siRNA递送手段来实现其完整的治疗潜力。虽然一些使用脂质体或其它纳米粒子的跨膜转运方法也已经报道,但是因毒性和其他因素其治疗应用受到限制。因此,需要新型,更具有特定性的方法以系统递送siRNA。
3、 脂蛋白,尤其是HDL ,是脂质运输系统的必要成分。 HDL在胆固醇逆转中起着举足轻重的作用,通过促进外周细胞多余胆固醇返回到肝脏进行消除(胆汁排泄或在肝肠循环使用)。关于内源性,HDL纳米粒是完全可生物降解的,并且也无引起免疫反应的相关报道。此外,众所周知,HDL纳米粒可以逃避网状内皮系统的吸收,比大多数药物制剂或其他脂蛋白,他们在循环中表现出更长的滞留时间。HDL纳米粒循环的核心部分就是摄取,通过清道夫受体B类1型( SR-B1 )受体介导的机制,这种受体主要表达在肝脏和恶性肿瘤细胞。基于体积小,屏蔽疏水核心,受体介导的摄取能力等这些有效特征,HDL纳米粒是一种理想的药物载体。重组HDL是
4、由人的HDL合成得到的。该rHDL纳米粒的组成部分有磷脂酰胆碱,载脂蛋白A -1 ,胆固醇和胆甾醇酯(图1A)。rHDL纳米粒都很小,直径约12至18纳米。 为了研究siRNA靶向输送途径,一些肿瘤细胞受体已被获知。SR- B1受体主要在肝脏中的表达,也在肾上腺或正常卵巢组织也较小程度表达。然而,在恶性肿瘤细胞中SR - B1非常显著表达。增加HDL摄取可使肿瘤细胞产生较高增殖率。例如,乳腺癌细胞通过增加SR- B1的表达来增加胆固醇酯的摄取。因此,考虑到SR- B1在HDL中的作用,我们认为rHDL纳米粒可以作为选择性输送的有效载体。 siRNA基因沉默治疗非常有效,其他方法很难靶向这些基因
5、。信号传感器和转录激活因子3 STAT3 都可以介导正常细胞对多种细胞因子和生长因子的反应 。激活STAT3是恶性肿瘤转化和发展(例如,细胞增殖,分化和存活)的关键过程。虽然STAT3可以在许多实体瘤里激活,但是它在正常组织中表达,并且参与许多正常细胞过程。因此,使用小分子抑制剂或其他非特异性靶向STAT3的手段可能会导致许多不必要的副作用,因此需要有效途径限制毒性。同样,粘着斑激酶( FAK )对于肿瘤细胞存活,转移,入侵也非常重要。在卵巢癌患者中, FAK过度表达与侵袭性肿瘤的特征相关,这有助于弱势细胞生存。概念证明,我们在卵巢癌和大肠癌模型中证实使用r HDL纳米粒靶向STAT3和FAK
6、治疗有效性。原料与方法rHDL纳米粒的制备和siRNA的偶联siRNA偶联到rHDL纳米粒,并储存在-20C。简单地说,载脂蛋白A-I ,是rHDL纳米粒的主要核蛋白,在生产蛋白过程中用质粒载体进行分离和纯化。然后,脂类混合物(胆固醇 C /胆固醇油酸 CE /蛋黄卵磷脂PC,摩尔比的1:5:1.3:115 )在氮气流中干燥。5mg的siRNA用25g低聚赖氨酸(平均分子量为500-2000 )在30预先孵育 30分钟,然后加入到脂质成分中。 低聚赖氨酸 / siRNA混合物偶联脂质,分散在60l的DMSO和1.4ml的缓冲液( 10mM Tris,0.1M KCl,1mM pH为8.0的ED
7、TA) 。胆酸钠,140L ( 100mg/ml溶于为PBS )形成的蛋黄卵磷脂摩和胆酸的摩尔比为1:1.6 。载脂蛋白A- I( 12.7mg/ml)溶于0.4mlPBS加入到混合物中,终体积用PBS调整到2ml 。4 孵育12h, 接着用2L的PBS透析 2天,换 3次透析缓冲液。制剂的稳定性凝胶排阻色谱中用的RiboGreen检测 。rHDL/靶向siRNA溶液用0.9 的生理盐水稀释到为0.2mg/Kg的siRNA/0.2ml rHDL的溶液。此外, rHDL纳米粒子的电位使用电位粒度分析仪检测 。简单地说,1ml的纳米粒加入1ml的比色皿中作zeta电势检测。透射电子显微镜法在0.1
8、25M乙酸铵, 2.6 mM的碳酸铵, 0.26 mM的EDTA ,pH值7.4中透析后, rHDL样品用 pH值7.2的2磷钨酸钠并放在福尔瓦/200目镍网支持膜包裹的碳涂层进行负染 。颗粒明显可见(放大50000倍),通过使用Zeiss 910透射型电子显微镜。得到的图片有所增强,粒径可通过Adobe ImageCS2 软件检测。细胞系和培养条件衍生和源于人体上皮卵巢癌细胞系的HeyA8 , SKOV3ip1,HeyA8 -MDR细胞系在之前已有研究。人类大肠癌细胞株(HCT116)对于Dr Lee Ellis。本篇文章中所用到所有细胞株都是德克萨斯大学MD安德森癌症中心的,通过表征细胞线
9、芯的研究得到认证。简单地说,HeyA8和SKOV3ip1细胞在添加15%胎牛血清和0.1%硫酸庆大霉素的RPMI1640培养基中培养。HeyA8-MDR细胞在添加有15%的FBS和300 ng / ml紫杉醇以及0.1%硫酸庆大霉素的RPMI 1640培养基培养。HCT116细胞在添加10%的FBS和0.1%硫酸庆大霉素的改良伊格尔培养基中培养。所有的细胞都保存在37C,5% CO2/95%的孵箱中。体外基因沉默STAT3 (靶序列5 - GCCUCUCUGCA GAAUUCAA -3 ) ,粘着斑激酶(靶序列5CCACCUGGGCCAGUAUUAU -3 ),和一个非定标性的控制序列(靶序列
10、的5 - UUCUCCGAACGUGUCACGU -3 )均购自Sigma-Aldrich公司 ,RNAiFect转染试剂按照厂家建议使用。简单地说, SKOV3ip1和HeyA8 - MDR卵巢癌细胞系在一式三份的六孔板用1.33g特定siRNA/孔进行转染,在70 处汇合。分别使用1:3.75的siRNA和转染试剂进行转染,对照siRNA和STAT3 siRNA组无血清培养基培养6 h。RNA提取和互补DNA的制备细胞使用Trizol而均化。RNA通过提取(氯仿),沉淀(异丙醇)和纯化(75%乙醇)。cDNA通过使用SuperScript-II逆转录酶得到2.0g高质量的RNA微序列分析在
11、SKOV3细胞使用Illumina平台得到cDNA微序列。根据厂家的建议使用RNAiFect转染试剂,该细胞置于一式三份含STAT3(8.0g)或对照siRNA(8.0g)的10厘米细胞培养板。在微序列分析前,STAT3基因沉默利用蛋白质印迹在蛋白质水平得到证实。从微序列分析得到的基因表达数据,加载到异丙醇独创性通路数据库,关于凋亡基因的不同表达可以验证选择性。聚合酶链反应分析反转录聚合酶连锁反应(RT-PCR)可以利用cDNA预先形成正常人体器官和癌症细胞系。人类肝中的cDNA利用SR-B1表达作为阳性对照组。RT-PCR在应用生物系统公司9500系列中完成,使用条件为之前已作介绍。肌动蛋白
12、作为一个内源性对照。平均改变倍数已经报道。蛋白质印迹分析用改良放射免疫沉淀裂解缓冲液制备细胞裂解液。在8 SDS-PAGE中分离蛋白质,并转移到硝酸纤维素膜,随后与STAT3 ( 1:2500 )或FAK(1:5000 )抗体在4 C孵育过夜。主要抗体通过抗鼠免疫球蛋白G和化学发光检测试剂盒检测。肌动蛋白或黏着斑蛋白证实相同的负载量。卵巢癌细胞细胞凋亡分析对照或STAT3 siRNA处理后24小时后,卵巢癌细胞(SKOV3ip1和HeyA8-MDR)细胞用多烯紫杉醇( 分别为1或500nM)处理72小时,水洗,并用5l膜联蛋白V / PE和 7AAD抗体孵育30分钟。流式细胞仪分析之前的样品。
13、免疫组织化学新鲜冷冻部分由CD31染色(1:800稀释),ki - 67染色是在5m厚的福尔马林固定石蜡包埋标本上。为了定量微血管密度,细胞增殖指数(ki - 67)和半胱氨酸蛋白酶-3清除率,5个随机区域每个肿瘤放大100倍进行研究。在人类上皮卵巢肿瘤(n = 50)在SB-R1的表达可以用福尔马林固定石蜡包埋标本检测,这种方法源于德克萨斯大学MD安德森癌症中心,是经过机构审查委员会批准。高表达或低表达都是由妇科病理学家使用下列程序来决定的:强度从1到3,分布是从1到4。TUNEL染色取新鲜冷冻的实验组(SKOV3ip1模型)肿瘤组织部分,通过末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸缺口尾部
14、标记进行末端染色,再用1:10,000的Hoechst进行复染。凋亡小体通过绿色荧光表示。Tunel阳性细胞在10个200区域,每组分为5个部分进行计数,得到平均值。siRNA选择性递送SKOV3ip1雌性裸鼠用0.2mg/Kg的荧光标记对照siRNA 或无标记对照siRNA (每组n = 3时)静脉注射或腹腔注射 。 48小时后,处死小鼠,收集肿瘤和器官(脑,心脏,肺,肝,肾,脾)并冷冻。荧光染色取新鲜冰冻得原位卵巢癌模型( SKOV3ip1 )的肿瘤组织 ,置于丙酮中,用PBS洗涤,并用Hoechst (1:10,000 )复染。荧光显微镜在400 的视野来分析幻灯片。每张幻灯片有十个高倍
15、区域,取平均值。原位卵巢癌模型雌性裸鼠( 1012周龄)购自美国美国国家癌症研究所。所有的实验都是由MD安德森癌症中心机构动物护理和使用委员会批准。体内FAK靶向对于FAK靶向实验( SKOV3ip1模型),治疗组分为(每组n=10): 1)空rHDL纳米粒,2)对照siRNA / rHDL,3)FAK siRNA / rHDL,4)对照siRNA +多烯紫杉醇,5)FAK siRNA / rHDL+多烯紫杉醇体内STAT3靶向STAT3基因沉默实验,根据以下各组(每组n=10)进行试验 : 1 )对照siRNA / rHDL, 2 )对照siRNA / rHDL+多烯紫杉醇, 3 ) STA
16、T3 siRNA / rHDL,4 )STAT3 siRNA / rHDL+多烯紫杉醇 。适合的肿瘤细胞来源于卵巢癌小鼠模型( HeyA8,SKOV3ip1和HeyA8 MDR )用腹腔注射接种。小鼠随机饲养并在第7天后开始处理。约HeyA8模型3周后或SKOV3ip1和 HEYA8 - MDR 5周后,解剖小鼠,收集肿瘤。大肠癌转移模型对于大肠癌转移模型, HCT116细胞注入雌性裸鼠脾脏(治疗组 N = 10)。两个星期后,按照前面描述的开始用奥沙利铂处理,根据图2C所示。4周后,解剖小鼠,收集肿瘤 体内沉默STAT3或FAK 基因的有效剂量通过在SKOV3ip1模型小鼠注入剂量范围为0.
17、1 0.2mg/KgSTAT3 siRNA / rHDL或FAK siRNA / rHDL来测定。小鼠在第2,4或6天解剖 。收集肿瘤组织,采用蛋白质印迹分析蛋白表达统计分析如果呈正态分布连续变量可以使用t检验(在两个组)或方差分析(所有组)进行比较。在非参数值中,连续变量使用曼-怀氏等级和检验或秩和检验(所有组)进行比较。rHDL体内研究将治疗组每10只小鼠被随机分配。我们使用SPSS和GraphPadPrism软件对所有结果进行处。我们认为P 0 .05就是显著差异。本研究中所有的数据使用双侧分析。结果包含 RNAi 的rHDL纳米粒的制备因为RNAi分子是高度离子化,主要是因为磷酸基团带
18、负电荷,我们设计了一个新颖制剂是将siRNA偶联到rHDL里。反义寡赖氨酸多肽含有大约40赖氨酸残基,这可使siRNA偶联到rHDL。siRNA偶联后,rHDL 纳米粒的直径约10 nm(图1,A和B)和带中性电荷(电位3.2 mV)。rHDL纳米粒具有强大的有效载荷承载能力(最高至4mg siRNA /ml)。此外,含有siRNA纳米粒是非常稳定的。因为样品储存两周并再次透析后siRNA没有从rHDL损失。SR-B1表达在肿瘤细胞在研究rHDL作为siRNA的有效递送系统之前, 我们首先分析了多个细胞系和人类肿瘤存在的SR-B1受体。在50种人类卵巢上皮癌, 96%的肿瘤细胞表达了SR-B1
19、受体(图1 C)。此外,我们检测在人类正常器官的SR-B1表达并用RT-PCR分析乳腺癌、直肠癌、胰腺癌和卵巢癌细胞系的表达 (图W1)。用RT-PCR也检测了一些细胞系(图1 D)。所有的癌症细胞系测试证实了SR-B1的高水平表达。在正常的组织里,只有肝脏SR-B1高度表达,而其他组织很少表达。Figure 1.Characterization of rHDL nanoparticles. (A) Illustrations of rHDL nanoparticle composition. (B) Electron micrograph of rHDLnanoparticles conta
20、ining control siRNA. (C) Expression of SR-B1 in human epithelial ovarian cancer (IHC). (D) mRNA expression of SR-B1 in ovarian and colorectal cancer cell lines.在体内rHDL纳米粒的选择性输送 比起正常组织,考虑到SR-B1受体在肿瘤细胞中的高度表达,我们接下来检测用rHDL纳米粒递送siRNA 在体内的有效性。荧光标记(Alexa555)siRNA被包入到rHDL纳米粒子,并进行IV或IP(图2)。单剂量注射后,siRNA均匀分布到约
21、80%的特定肿瘤组织。我们进一步验证rHDL纳米粒的递送是否由受体介导。为了解决这个问题,,我们首先分析了用Alexa555标记siRNA / rHDL纳米粒处理的小鼠器官(图W2)。rHDL纳米粒在肝脏中的吸收最高,而在大脑、心脏、肺、肾、或脾中吸收很少。静脉注射或腹腔注射rHDL / Alexa555后,肿瘤组织对rHDL纳米粒的吸收无显著差异。用该方法进行长期治疗实验之前,我们下一个验证STAT3 siRNA偶联到rHDL纳米颗粒(siRNA / rHDL)在体内基因沉默的有效性。STAT3 siRNA的有效性首先在体外SKOV3细胞上测试(图W3A),与对照组siRNA相比,5g 的S
22、TAT3 siRNA导致STAT3蛋白表达超过80%的减少。接下来,检测在体内沉默STAT3基因的有效剂量。在SKOV3ip1小鼠模型中我们注射STAT3 siRNA /rHDL,剂量范围从0.1至0.2mg/Kg。第四天,单剂量注射0.2mg/Kg的siRNA,我们发现降低了88% STAT3蛋白水平(图W3B),在第6天,蛋白表达有些回升。根据这个实验,我们在后续实验中使用0.2mg/Kg的剂量。另一个关于癌症生长和转移的关键基因,FAK也具有类似的结果(图W3C)。在SKOV3ip1小鼠模型中单剂量注射FAK siRNA /rHDL纳米粒4天后,FAK水平降低了87% 。Figure 2
23、.Systemic delivery of siRNA using rHDL nanoparticles. (A) Uptake of Alexa555-labeled siRNA/rHDL in SKOV3ip1 tumors. A single IV or IP injection of 0.2 mg/kg of Alexa555 labeled or 0.2 mg/kg of IV and IP injection of untagged siRNA/rHDL was administered in mice bearing SKOV3ip1 tumors, and 48 hours l
24、ater, tumors were harvested and counterstained with Hoechst (blue), and siRNA (red) uptake was assessed with fluorescence microscopy. The H&E image shows tumor histologic diagnosis. The adjacent graph shows percent Alexa555-positive cells. (B)In vivo efficacy of STAT3 siRNA/rHDL in chemosensitive (H
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