健脾合剂对腹泻型肠易激综合症大鼠结肠miRNA表达谱的影响.pdf

Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化动物模型与动物实验研究健脾合剂对腹泻型肠易激综合症大鼠结肠miRNA表达谱的影响王萌1，吴婷婷1，丁姮月1，梁国强1，3，杨欣2，张培培1，孙宏文1（1.南京中医药大学附属苏州市中医医院 苏州 215009；2.苏州科技城医院 苏州 215153；3.苏州市吴门医派研究院 苏州 215009）摘要：目的观察微小核糖核酸（Micro-ribonucleic acid，miRNA）在腹泻型肠易激综合征（Irritable bowel syndrome-diarrhea，IBS-D）大鼠和健脾合剂治疗后的大鼠结肠组织中表达的差异，预测健脾合剂治疗IBS-D过程中参与的miRNA及对应的基因，为寻找IBS-D的潜在治疗靶点提供基础。方法将大鼠随机分为空白组、模型组和中药组，每组8只。模型组与中药组均采用急慢性刺激法+番泻叶灌胃制造IBS-D模型，中药组于造模后予以健脾合剂灌胃，连续14天；观察并记录大鼠一般情况、体重及粪便Bristol积分；采用苏木精-伊红（Hematoxylin-eosin staining，HE）染色法观察各组大鼠结肠组织病理学变化；对各组大鼠结肠组织进行转录组测序，筛选差异表达的miRNA并进行映射；对筛选出的共同miRNA对应的靶基因进行GO（Gene oncology）功能富集分析和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路富集分析。结果与模型组相比，中药组大鼠体重显著增加（P0.01），粪便Bristol积分明显下降（P 3 g）构建测序文库。2.5miRNA测序数据统计及比对分析从总RNA中电泳切胶得到small RNA，分别连接5 接头和3 接头，用接头引物进行反转录聚合酶链反应（Reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR），构 建 小 RNA 文 库。用 Illumina Novaseq 6000基因DNA测序仪进行测序，测序部分交由上海美吉公司完成；对原始测序数据进行测序相关质量评估；将质控后的数据，即clean data（reads）与参考基因组进行比对，参考基因来源：Rattus_norvegicus，参考基因 组 版 本：Rnor_6.0，参 考 基 因 组 来 源：http:/asia.ensembl.org/Rattus_norvegicus/Info/Index，比 对 到 的reads数从9952451到17785312不等。2.6表达量及表达差异分析使用miRDeep软件统计miRNA表达量，基于表达定量结果，使用DESeq2软件进行组间差异基因分析，获得发生差异表达的基因，筛选阈值为：差异倍数fold change（|log2FC|）1且显著性水平P（Padjust）0.05。2.7miRNA靶基因分析采用软件Goatools对靶基因集中的基因进行 GO富集分析，从而获得该基因集中的基因主要具有哪些GO功能。使用方法为Fisher精确检验，当P0.05时，认为此GO功能存在显著富集情况。采用R脚本对靶基因集中的基因进行KEGG通路富集分析，当P0.05时，认为此KEGG通路功能存在显著富集情况，按富集程度筛选排名前20的目标。3 结果 3.1大鼠一般情况造模前，所有大鼠精神良好，活泼好动，毛色光亮，饮食正常，大便干稀适中；造模开始后，模型大鼠逐渐出现精神萎靡，活动减少，毛色枯燥，饮食减少，大便稀溏，甚至呈水样，伴见体重下降，初步提示造模成功；给药后，中药组大鼠体重逐渐上升，精神、活动好转，毛色恢复光亮，大便转干。如图1表示，给药第1天，模型组与中药组大鼠体重明显低于空白组（P0.01）；给药第 14 天，中药组体重较模型组明显增加（P0.01）。3.2大鼠粪便Bristol评分造模后，模型大鼠粪便 Bristol评分显著上升（P02468给药第1天给药第14天Bristol评分（分）空白组模型组中药组*#&图2各组大鼠粪便Bristol评分比较（n=8）注：与空白组相比，*P0.01；与模型组相比，&P0.05。0100200300400给药第1天给药第14天体重（g）空白组模型组中药组*#&图1各组大鼠体重比较（n=8）注：与空白组相比，*P0.01；与模型组相比，&P0.05。2073 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第六期 Vol.25 No.6 0.01）；给药14天后，模型组粪便积分仍较高，粪质稀薄呈水样，中药组较之明显好转，Bristol评分显著下降（P0.01），具体见图2。3.3病理结果大鼠结肠HE染色结果显示，空白组大鼠黏膜上皮完整，固有层腺体排列整齐规则，间质无明显淋巴细胞浸润；模型组见黏膜上皮轻度破损及水肿，上皮细胞排列不整，周围少许炎性细胞浸润；中药组与模型组相比较，上皮破损及水肿减轻，上述情况得到有效改善，见图3。3.4miRNA差异表达基因筛选RNA-seq测序结果表明（图4A-4C），空白组与模型组相比，差异表达的miRNA共109个，其中80个上调，29 个下调；模型组与中药组相比，差异表达的miRNA共109个，其中19个上调，90个下调。通过韦图3大鼠结肠组织病理组织学观察（HE染色，100，200）图4组间有统计学差异的miRNA2074 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化动物模型与动物实验研究恩图将两次比较结果进行比对，共有81个miRNA相同，见图4D；在模型组与空白组比较中下调、中药组与模型组比较中上调的有7个；在模型组与空白组比较中上调、中药组与模型组比较中下调的有74个，具体见表1。表1大鼠结肠组织显著差异表达miRNArno-miR-382-3prno-miR-541-5p2_4654rno-miR-299a-3prno-miR-377-3prno-miR-127-5prno-miR-667-3prno-miR-410-3prno-miR-434-3prno-miR-496-3prno-miR-212-3prno-miR-300-3prno-miR-154-3prno-miR-134-5prno-miR-369-3prno-miR-485-3p2_3838rno-miR-382-5prno-miR-582-5prno-miR-494-5prno-miR-434-5p15_20444rno-miR-136-5prno-miR-409a-3prno-miR-665rno-miR-673-3prno-miR-493-5prno-miR-369-5prno-miR-543-3prno-miR-376b-3prno-miR-329-3prno-miR-126brno-miR-376a-5prno-miR-18a-5prno-miR-132-5prno-miR-540-3prno-miR-582-3pyes|upyes|upyes|upyes|upyes|upyes|upyes|upyes|upyes|upyes|upyes|upyes|upyes|upyes|upyes|upyes|upyes|upyes|upyes|upyes|upyes|upyes|upyes|upyes|upyes|upyes|upyes|upyes|upyes|upyes|upyes|upyes|upyes|upyes|upyes|upyes|upyes|upyes|downyes|downyes|downyes|downyes|downyes|downyes|downyes|downyes|downyes|downyes|downyes|downyes|downyes|downyes|downyes|downyes|downyes|downyes|downyes|downyes|downyes|downyes|downyes|downyes|downyes|downyes|downyes|downyes|downyes|downyes|downyes|downyes|downyes|downyes|downyes|downyes|downmiRNA空白组vs模型组模型组vs中药组rno-miR-485-5p16_21015rno-miR-495rno-miR-21-3prno-miR-412-5prno-miR-411-5prno-miR-487b-3prno-miR-494-3prno-miR-136-3prno-miR-409a-5prno-miR-183-3prno-miR-379-5prno-miR-493-3prno-miR-376c-3prno-miR-299b-5prno-miR-484rno-miR-379-3prno-miR-433-3prno-miR-449a-5prno-miR-431rno-miR-329-5prno-miR-376a-3prno-miR-132-3prno-miR-541-3prno-miR-370-3prno-miR-23a-5prno-miR-299a-5prno-miR-27a-5prno-miR-127-3prno-miR-1193-3prno-miR-341rno-miR-6331rno-miR-337-5prno-miR-300-5prno-miR-411-3prno-miR-212-5prno-miR-758-3prno-miR-205rno-miR-31a-5prno-miR-224-5prno-miR-146a-5prno-miR-10b-3prno-miR-211-5prno-miR-451-5pyes|upyes|upyes|upyes|upyes|upyes|upyes|upyes|upyes|upyes|upyes|upyes|upyes|upyes|upyes|upyes|upyes|upyes|upyes|upyes|upyes|upyes|upyes|upyes|upyes|upyes|upyes|upyes|upyes|upyes|upyes|upyes|upyes|upyes|upyes|upyes|upyes|upyes|downyes|downyes|downyes|downyes|downyes|downyes|downyes|downyes|downyes|downyes|downyes|downyes|downyes|downyes|downyes|downyes|downyes|downyes|downyes|downyes|downyes|downyes|downyes|downyes|downyes|downyes|downyes|downyes|downyes|downyes|downyes|downyes|downyes|downyes|downyes|downyes|downyes|downyes|downyes|downyes|downyes|downyes|downyes|downyes|upyes|upyes|upyes|upyes|upyes|upyes|up续表miRNA空白组vs模型组模型组vs中药组下转续表2075 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第六期 Vol.25 No.6 3.5差异miRNA靶基因GO功能富集分析对受健脾合剂调控差异表达miRNA的靶基因进行GO功能富集分析，结果显示，差异表达的miRNA靶基因所涉及的功能及过程主要集中在囊泡定位、髓鞘形成、突触囊泡转运、细胞器膜融合、发育性生长负调控等生理过程。具体见图5、图6。图5GO富集分析（空白组VS模型组）注：*表示FDR 0.001。图6GO富集分析（模型组VS中药组）注：*表示FDR 0.001。2076 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化动物模型与动物实验研究3.6差异miRNA靶基因KEGG富集分析对受健脾合剂调控差异表达miRNA的靶基因进行KEGG通路富集分析，结果显示，差异表达的基因主要富集在MAPK、Hippo、Wnt、Toll-like receptor等信号通路，见图7、图8。4 讨论 肠易激综合症的发病机制复杂多样，目前尚无定论，一般认为，内脏高敏和胃肠动力异常是其基本的病理生理特点8。本实验采用急-慢应激法联合番泻叶灌胃的复合造模方法构建大鼠IBS-D模型。急-慢应激法通过给予大鼠随机反复多因素刺激，从脑-肠-轴角度改变大鼠内脏敏感性6；番泻叶短期灌胃可以造成大鼠功能性腹泻状态9。在本实验中，前期急-慢应急法刺激下的模型大鼠逐渐活动减少、情绪激动易激惹、毛发枯燥无光泽、大便稀烂、体重下降，加用番泻叶灌胃后，体重进一步下降，Bristol粪便积分显著上升，解剖取大鼠结肠组织进行观察，发现结肠组织未见出血糜烂、水肿溃疡等明显器质性病变，HE染色见有少量炎性细胞浸润，基本符合腹泻型肠易激的临床症状和镜下特征，证明该造模方法可以成功模拟IBS-D患者的基本特征，且持久稳定、可重复性好，值得推广应用。中医根据IBS-D腹痛腹泻的基本特征，一般将其归属于“泄泻”范畴，并认为脾虚湿盛贯穿于IBS-D全图7KEGG富集分析（空白组VS模型组）图8KEGG富集分析（模型组VS中药组）2077 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第六期 Vol.25 No.6 过程，是其发病的总病机4。感受外邪、饮食不节、劳倦体虚、七情内伤等各种病因导致脾胃虚弱，运化功能失常，脾失健运，湿浊阻于大肠而发为泄泻，故治疗上以健脾化湿为主。健脾合剂包括党参、白术、茯苓、甘草、山药和陈皮六味药。方中党参补脾养胃，健运中气。现代药理研究发现党参可以抑制胃肠道平滑肌痉挛，通过增加前列腺素含量保护消化道黏膜10。白术益气健脾，燥湿利水。白术多糖可以调节脾虚型大鼠肠道菌群失衡，白术内脂可以有效降低促炎因子肿瘤坏死因子、白介素1、白介素6水平，发挥抗炎作用11。茯苓渗湿利水，健脾宁心。研究表明茯苓通过抑制肠粘膜内皮细胞一氧化碳、内皮素-1及血栓素A2的分泌，改善肠道微循环，修复肠粘膜屏障12。炙甘草益气和中，调和阴阳。甘草苷有明显的抗抑郁、抗炎作用13。山药补脾养胃生津，山药多糖可以抑制小鼠胃和小肠排空功能14。陈皮理气健脾，燥湿化痰，具有双向调节胃肠道平滑肌的作用15。综上所述，健脾合剂具有益气健脾，渗湿止泻功效，是治疗IBS-D的良方。转录组测序的研究对象为特定细胞在某一功能状态下所能转录出来的所有RNA的总和，其中主要包括miRNA等。miRNA是一类长度约为20-24个核苷酸的小RNA，其在细胞内的调节具有多样性，广泛参与机体各项生理病理过程及信号通路的激活与抑制。本实验对空白组、模型组、中药组大鼠结肠组织进行转录组学分析，在空白组与模型组、模型组与中药组各组间差异表达的miRNA共有109个，两组比较结果互相比对则发现其中有 81 个 miRNA 是相同的,包括 miRNA-665、miRNA-132-5p、miRNA-132-3p、miRNA-21-3p、miR-146a-5p等。miRNA-665在模型组中上调，在中药组中则表现为下调，而研究发现miRNA-665参与结肠 细 胞 的 凋 亡16，说 明 健 脾 合 剂 可 以 通 过 抑 制miRNA-665的表达，减少细胞凋亡，保持肠粘膜完整性；Kim 等17研 究 发 现 miRNA-132 通 过 负 调 节FOXO3a 促 进 炎 症 细 胞 因 子 的 表 达，本 实 验 中，miRNA-132-5p、miRNA-132-3p在模型组显著上调，在中药组显著下调，说明健脾合剂通过抑制miRNA-132-5p、miRNA-132-3p的表达发挥抗炎作用；同时，本实验中miRNA-21-3p也在中药组中呈现低表达，该miRNA也与肠道炎症反应密切相关18；与之相反的则是miRNA-146a-5p，其在模型组中显著下调，在中药组中显著上调，miR-146可以改善肠上皮屏障功能19，提示健脾合剂通过促进miRNA-146a-5p的表达从而发挥修复肠粘膜屏障功能的作用。差异表达miRNA的靶基因GO功能富集和KEGG通路富集分析结果显示，健脾合剂参与多种生物过程包括生物调节、细胞代谢，参与多种分子功能及细胞组分，更参与了机体多条生命活动的重要通路，包括MAPK、Wnt、Hippo等信号通路。MAPK信号通路参与细胞增殖与分化、免疫反应等一系列生理、病理过程，它能从增加内脏高敏性、激活异常免疫调控等方面导致 IBS-D 的发病20-21。Hippo信号通路参与细胞再生与肠粘膜修复过程，并在维持肠上皮细胞间连接方面也有积极影响22。Wnt信号通路参与调控肠隐窝干细胞的分化过程，其在维持肠道干细胞稳态和修复损伤方面有重要作用23-24。在本实验中，miRNA-337-5p、miRNA-495、miRNA-126b、miRNA-299b-5p、miRNA-299a-5p等在模型组显著上调，在中药组显著下调，而这 些 miRNA 与 MAPK 相 关 通 路 的 激 活 有 关25-27；miRNA-31a-5p在模型组显著下调，在中药组则表现为上调，此基因可以激活Hippo、Wnt信号通路28。由此可见，健脾合剂可以通过抑制MAPK信号通路的活性，上调 Hippo、Wnt信号通路的表达，降低内脏敏感性，维持肠道干细胞稳态，修复肠粘膜屏障，最终达到治疗IBS-D的效果。综上所述，健脾合剂能够调节相关 miRNA 的表达，通过调控MAPK、Hippo、Wnt等信号通路发挥干预腹泻型肠易激综合症的作用。但其对上述基因、信号通路的影响仍需应用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）等方法进行下一步研究与验证。本研究从转录因子的角度为健脾合剂治疗腹泻型肠易激综合症的作用机制提供了线索与思路，为健脾合剂的下一步基础研究与临床应用提供了理论指导。参考文献 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IBS-D with Jianpi Mixture,providing a basis for finding potential therapeutic targets for IBS-D.Methods The rats were randomly divided into a blank group,a model group and a 2079 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第六期 Vol.25 No.6 traditional Chinese medicine group,with 8 rats in each group.Both the model group and the Chinese medicine group used acute and chronic stimulation+senna leaf gavage to make the IBS-D model.The Chinese medicine group was gavaged with Jianpi Mixture after model building for 14 days.General condition,body weight and Bristol score were observed and recorded.Hematoxylin-eosin(HE)staining was used to observe the histopathological changes of colon in each group of rats.Transcriptome sequencing of rat colon tissue in each group to screen and map differentially expressed miRNAs.Perform GO(Gene oncology)functional enrichment analysis and KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)pathway enrichment analysis on the target genes corresponding to the screened common miRNAs.ResultsCompared with the model group,the weight of the rats in the Chinese medicine group increased significantly(P0.01),and the Bristol score of the feces decreased significantly(P0.01).The pathological damage of the colon tissue of rats in the Chinese medicine group was significantly reduced.Compared with the blank group,there were 109 differentially expressed genes in the model group,of which 80 were up-regulated and 29 were down-regulated.Compared with the model group,there were 109 differentially expressed genes in the traditional Chinese medicine group,of which 19 were up-regulated and 90 were down-regulated.Mapping the genes of the two comparisons found that 74 miRNAs in the model group were increased and 7 were decreased.The changes of these miRNAs were all reversed after the intervention of traditional Chinese medicine.The GO function enrichment analysis of target genes showed that Jianpi Mixture was mainly involved in synaptic vesicle positioning and transport,cytoplasmic transport,negative regulation of growth and development,and sugar transport after acting on rats.KEGG pathway enrichment analysis showed that MAPK,Wnt,Hippo,TNF,oxygen toxin,cAMP and other pathways were enriched.Conclusion After the intervention of Jianpi Mixture,IBS-D-related miRNA expression profiles have changed significantly;Jianpi Mixture may play a protective role in the treatment of IBS-D by regulating the MAPK signaling pathway and Wnt signaling pathway.Screening the core genes and predicting the miRNAs interacting with them provide a theoretical basis for the study of the pathogenesis of IBS-D and the therapeutic targets of Jianpi Mixture.Keywords:Transcriptomics,Jianpi Mixture,IBS-D,MAPK signaling pathway（责任编辑：刘玥辰）2080