古今千金黄连丸中两种降糖成分的含量测定.pdf

药物制剂与药品质量控制古今千金黄连丸中两种降糖成分的含量测定毛海龙保瑞万萧闫鸿丽(云南中医药大学.中药学院.中药学院暨云南省南药可持续利用研究重点实验室昆明)摘 要 目的 建立高效液相色谱()法测定古、今千金黄连丸中生物碱(表小檗碱、黄连碱、巴马汀、小檗碱)和梓醇的含量并比较其含量差异初步评价不同制备工艺不同配比下千金黄连丸治疗糖尿病药效差异 方法 生物碱溶剂为甲醇盐酸()检测条件为色谱柱 柱乙腈.磷酸二氢钾溶液()检测波长 柱温 流速 进样量 梓醇溶液为甲醇水()检测条件为色谱柱 柱甲醇.磷酸溶液()检测波长 柱温 流速 进样量 结果 所建立的方法专属性强 种成分的分离效果好在各自的线性范围内均具有良好的线性关系(.)重复性、精密度、稳定性及加样回收率考察均符合要求 古法 中 种生物碱含量都最高梓醇含量最低古法 中 种生物碱含量最低今法 各含量均高于古法 今法 中仅小檗碱含量略低于今法 其余均高与今法 主成分分析()结果表明 种千金黄连丸的化学成分含量有很大差异 结论 该方法简便、准确、重复性好可用于千金黄连丸的质量控制并为探究千金黄连丸药效差异提供理论基础关键词 千金黄连丸含量测定高效液相色谱法生物碱梓醇中图分类号 文献标识码 文章编号()./.开放科学(资源服务)标识码()(.)()().().:.().().:.().(.).千金黄连丸出自备急千金要方卷第二十一消渴第一书中写到“黄连一斤生地黄一斤 右二味绞地黄汁浸黄连出曝之燥复纳之令汁尽干之捣末蜜丸如梧子 服二十丸日三食前后无拘”后外台卷十一引肘后方写到“黄连一斤(去毛)生地黄十斤上为末绞生地黄取汁渍黄连出晒之燥复纳之令汁尽干为末炼蜜为丸如梧桐子大”两者不同之处在于前者地黄为一斤后者为十斤 方医药导报 年 月第 卷第 期中黄连为君苦寒具有泻火解毒之功生地为臣味甘、苦性寒能够养阴生津 二药相须配伍具有养阴清热、生津止渴的功效能够治疗阴虚燥热而致的消渴尤其善治疗上消现代研究表明千金黄连丸具有较好的降糖效果可用于糖尿病的治疗 目前临床上治疗糖尿病的西药都以降糖为目的治疗相对单一并且长期使用可能会出现胰岛素抵抗和失效等问题还可能发生低血糖、消化道反应、肝肾功能损坏等多种不良反应治疗糖尿病的药物开发需求仍然比较迫切而现今单靶点降糖药物开发也遭遇瓶颈期因而在传统药物特别是经典名方的基础上开发中药多靶点糖尿病治疗药物已成为研究热点 但如今千金黄连丸的研究多采用水煎法并且使用生地黄对该方的研究并未忠于原方古法制备与现代制备是否会与原方功效存在差异这一问题缺乏系统深入的针对性研究 研究表明黄连中小檗碱和黄连碱是其发挥降糖作用的主要成分而巴马汀和表小檗碱在治疗糖尿病方面具有协同作用 地黄中梓醇为主要降糖成分 笔者目前未见关于同时测定古今千金黄连丸中生物碱和梓醇的报道故本文采用高效液相色谱()法测定古法与现代制备的 和 千金黄连丸中生物碱(表小檗碱、黄连碱、巴马汀、小檗碱)和梓醇的含量具有创新性并比较其含量差异为后续探究其药效差异奠定基础同时也是为经典名方的研究提供一种新思路 仪器与试药.仪器 型高效液相色谱(美国 公司)型电子分析天平(奥豪斯仪器有限公司感量:.)型电子天平(上海青海仪器有限公司感量:.)旋转蒸发仪(上海泉杰仪器有限公司)超声波清洗仪(上海科导超声仪器有限公司)收稿日期 修回日期 基金项目云南省应用基础研究云南联合基金资助项目()云南省技术创新人才培养计划项目()云 南 省 科 技 人 才 和 平 台 计 划()云 南 省 科 技 人 才 和 平 台 计 划()云南中医药大学中药学院团队建设项目()作者简介 毛海龙()男贵州六盘水人在读硕士研究方向:临床应用药学:通信作者 闫鸿丽()女黑龙江鹤岗人高级实验师硕士研究方向:中药药理:.试药 黄连、生地黄购买于云南省昆明市螺蛳湾药材批发市场鲜地黄购买地为河南焦作经云南中医药大学中药学院生药教研室古今老师鉴定黄连为毛茛科植物黄连 .的干燥根茎生地黄为玄参科植物地黄 .的干燥块根鲜地黄为玄参科植物地黄 .的 新 鲜 块 根 表 小 檗 碱(批 号:含量:.)、黄连碱(批号:含量:.)、盐酸小檗碱(批号:含量:.)、梓醇(批号:含量:.)对照品(森岚科技有限公司)巴马汀对照品(成都普菲德生物技术有限公司批号:含量:.)磷酸二氢钾(批号:含量:.)、十二烷基硫酸钠(批号:含量:.)(北京百灵威科技有限公司)甲醇、乙腈均为色谱纯(默克股份联合公司)其余试剂均为分析纯 方法与结果.色谱条件.梓醇的色谱条件 色谱柱:柱(.)流动相:甲醇.磷酸溶液()流速:柱温:检测波长:进样量:进样时间:.生 物 碱 的 色 谱 条 件 色 谱 柱:柱(.)流动相:乙腈.磷酸二氢钾溶液()(每 毫升中加十二烷基硫酸钠.再 以 磷 酸 调 值 为.)流 速:柱温:检测波长:进样量:进样时间:.对照品溶液的制备.梓醇对照品溶液的制备 取适量梓醇对照品精密称定置于 量瓶中加入甲醇水()定容超声 使其溶解制成浓度为.的对照品溶液 经孔径.有机滤膜滤过即得梓醇对照品储备液于 冰箱中保存备用.生物碱对照品溶液的制备 取表小檗碱、盐酸黄连碱、巴马汀、盐酸小檗碱 个生物碱的对照品适量精密称定分别置于 量瓶中加入甲醇定容超声 使其溶解制成浓度分别为.、.、.、.的对照品溶液 经孔径.有机滤膜滤过即得各生物碱对照品储备液于 冰箱中保存备用分别取表小檗碱、盐酸黄连碱、巴马汀、盐酸小檗碱的对照品储备液、置于 量瓶中混 匀 制 成 浓 度 分 别 为.、.、.、.的生物碱混合对照品储备液于 冰箱中保存备用.供试品溶液的制备.黄连供试品的制备 取黄连粉末.用适量甲醇水()超声溶解充分摇匀滤过即得梓醇条件样品溶液同上使用甲醇盐酸()溶解即得生物碱条件样品溶液.鲜地黄汁供试品的制备 取鲜地黄榨汁取鲜地黄汁适量离心精密量取上清液 精密量取甲醇 加入超声 静置 离心取上清液 水浴挥干加甲醇水()定容至 摇匀即得梓醇条件样品溶液同上使用甲醇盐酸()溶解即得生物碱条件样品溶液.黄连水煎液供试品的制备取干燥至恒重的黄连饮片 加入 倍量的纯净水煎煮 后用 层 目纱布趁热过滤残渣收集煎液残渣同法再继续煎煮 次弃去残渣合并 次煎液制得黄连水煎液煎液于 减压浓缩成浸膏使用适量甲醇水()超声溶解充分摇匀过滤即得梓醇条件样品溶液同上使用甲醇盐酸()溶解即得生物碱条件样品溶液.生地黄水煎液供试品的制备取干燥至恒重的生地黄饮片 制备方法同“.节”.古法千金黄连丸供试品溶液的制备取适量的黄连粉末再分别取 倍、倍量鲜地黄榨汁用鲜地黄汁浸泡黄连置于太阳光下暴晒直至干燥制得、古法千金黄连丸分别取其 使用适量甲醇水()超声溶解充分摇匀过滤即得梓醇条件样品溶液同上使用甲醇盐酸()溶解即得生物碱条件样品溶液.今法千金黄连丸供试品溶液的制备取干燥至恒重的黄连饮片 再分别取生地黄、加入 倍量纯净水煎煮 后用 层 目纱布趁热过滤残渣收集煎液残渣同法再继续煎煮 次弃去残渣合并 次煎液制得、今法千金黄连丸煎液于 减压浓缩成浸膏使用适量甲醇水()超声溶解充分摇匀过滤即得梓醇条件样品溶液同上使用甲醇盐酸()溶解即得生物碱条件样品溶液.方法学考察.专属性考察移取“.节”下对照品溶液、“.节”下供试品溶液适量按“.节”下色谱条件分别进样分析采用 版软件作图 结果表明各供试品溶液中生物碱和梓醇的保留时间与对照品溶液中梓醇和生物碱的保留时间基本一致说明此方法专属性强 结果见图、图.线性关系考察 移取“.节”下对照品储备液适量分别用甲醇水()、甲醇盐酸()依次以 倍梯度稀释 次即得 份浓度不同的溶液按“.节”下分别进样分析记录峰面积 以浓度()为横坐标峰面积()为纵坐标进行线性回归其回归方程、线性范围和相关系数()等结果见表.精密度考察移取“.节”和“.节”下供试品溶液适量按“.节”下色谱条件分别进样分析均连续进样测定 次记录生物碱和梓醇的峰面积并计算 值 测得古法 千金黄连丸中表小檗碱、黄连碱、巴马汀、小檗碱、梓醇峰面积的 值分别为.、.、.、.、.古法千金黄连丸 分别为.、.、.、.今法 千金黄连丸 分别为.、.、.、.、.今法 的 分别为.、.、.、.、.表明仪器精密度良好.稳定性考察移取“.节”和“.节”下所制供试品溶液适量分别于室温下放置、和 按“.节”下色谱条件分别进样分析记录生物碱和梓醇的峰面积并计算 值 测得古法 千金黄连丸中表小檗碱、黄连碱、巴马汀、小檗碱、梓醇峰面积的 值分别为.、.、.、.、.古法 千金黄连丸的 分别为.、.、.、.、.今法 千金黄连丸的 分别为.、.、.、.、.今法 千金黄连丸的 分别为.、.、.、.、.说明 种供试品溶液在 内的稳定性良好.重复性考察按“.节”和“.节”下供试品溶液的制备方法各平行制备 份按“.节”下色谱条件分别进样分析记录生物碱和梓醇的峰面积计算各含量并计算含量 值 测得古法 千金黄连丸中表小檗碱、黄连碱、巴马汀、小檗碱、梓醇含量的 值分别为.、.、.、.、.古法 千金黄连丸的 分别为.、.、.、.、.今法 千金黄连丸的 分别为.、.、.、.、.今法 千金黄连丸的 分别为.、.、.、.、.说明该方法的重复性良好.加样回收率实验 取 份已知梓醇含量的样医药导报 年 月第 卷第 期 .生物碱混标对照品.黄连供试品.黄连水煎供试品.地黄水煎供试品.鲜地黄供试品.古法 千金黄连丸供试品.古法 千金黄连丸供试品.今法 千金黄连丸供试品.今法 千金黄连丸供试品.表小檗碱.黄连碱.巴马汀.小檗碱图 生物碱专属性实验 色谱图.梓醇对照品.黄连供试品.黄连水煎供试品.地黄水煎供试品.鲜地黄供试品.古法 千金黄连丸供试品.古法 千金黄连丸供试品.今法 千金黄连丸供试品.今法 千金黄连丸供试品.梓醇图 梓醇专属性实验 色谱图.表 种成分的回归方程及线性范围.对照品回归方程相关系数()线性范围/()表小檗碱 .黄连碱 .巴马汀 .小檗碱 .梓醇 .品精密加入等量的梓醇对照品溶液按“.节”和“.节”下制备供试品溶液按“.节”下色谱条件进样分析测定梓醇的含量计算回收率取 份已知生物碱含量的样品精密加入等量的生物碱对照品溶液按“.节”和“.节”下制备供试品溶液按“.节”下色谱条件进样分析测定各生物碱的含量计算回收率 结果见表 结果表明方法的准确度良好.千金黄连丸中生物碱和梓醇的含量测定 按“.节”方法制备供试品 批按“.节”下色谱条件分别进样分析记录峰面积采用外标法计算确定各供试品中生物碱和梓醇的含量结果见表 由表 可知当黄连与鲜地黄配伍生物碱与梓醇含量均少于单药黄连与地黄配伍生物碱含量少于单药但增加了梓醇含量 种千金黄连丸相互比较古法 中 种生物碱含量都最高梓醇含量最低古法 中 种生物碱含量最低今法 各含量均高于古法 今法 中仅小檗碱含量略低于今法 其余均高于今法.千金黄连丸的主成分分析()分析 以上述 批千金黄连丸 个成分的含量为变量运用 .版软件进行主成分分析结果见图 批千金黄连丸直观的分为 类且符表 生物碱和梓醇加样回收率实验结果.项目平均回收率古法 表小檗碱.黄连碱.巴马汀.小檗碱.梓醇.古法 表小檗碱.黄连碱.巴马汀.小檗碱.梓醇.项目平均回收率今法 表小檗碱.黄连碱.巴马汀.小檗碱.梓醇.今法 表小檗碱.黄连碱.巴马汀.小檗碱.梓醇.合所做的 种千金黄连丸表明 种千金黄连丸的化学成分含量有很大差异 讨论本实验采用 法分析了黄连、鲜地黄汁、黄连水煎生地黄水煎以及古今千金黄连丸中的化学成分由图 可知黄连、黄连水煎及古今千金黄连丸中均检测到了表小檗碱、黄连碱、巴马汀和小檗碱地黄汁和地黄水煎未检测出 由图 可知鲜地黄汁、地黄水煎及古今千金黄连丸中均检测到了梓醇黄连、黄连水煎未检测出 说明黄连与鲜地黄汁、生地黄配伍后主要药效成分仍稳定存在当黄连与地黄鲜地黄配伍后主要有效降糖成分生物碱和梓醇含量减少但制备过程中是否有新物质生成需要进一步研究 贺梦云报道黄连丸治疗糖尿病优于单药黄连并且提高了小檗碱和黄连碱在糖尿病大鼠体内的吸收 雷蕾报道黄连、生地黄及其主要成分小檗碱、梓醇对血糖、血脂、葡萄糖耐量、血清胰岛素、胰岛素抵抗指数、胰岛素敏感指数等指标均有一表 不同供试品中 种成分含量测定结果.项目表小檗碱黄连碱巴马汀小檗碱梓醇黄连.黄连水煎.地黄水煎.鲜地黄.古法.古法.今法.今法.医药导报 年 月第 卷第 期图 千金黄连丸主成分分析.定疗效但是效果不如千金黄连丸 这体现了中药复方通过多成分、多途径、多靶点的协同作用发挥了单味药无法获得的治疗效果同时也揭示了中药复方无法单纯以含量来判定其药效差异后续将结合动物实验探究其药效差异本实验建立了 法测定不同配比古今千金黄连丸中表小檗碱、黄连碱、巴马汀、小檗碱和梓醇的含量经验证该法 个成分分离度良好线性考察、重复性考察、精密度考察、加样回收率考察均符合要求含量测定结果表明 种制备方法在有效降糖成分含量中各有优势 分析表明 种千金黄连丸化学成分含量有很大差异可以初步判定其降糖效果存在差异参考文献 李静陈泫锦佘成烨等.中药千金黄连丸的抗动脉粥样硬化作用.中南药学():.张晶晶.备急千金要方黄连丸对药方研究.中国民间疗法():.张印生.孙思邈医学全书.北京:中国中医药出版社:.雷蕾.基于传统用法的千金黄连丸治疗 型糖尿病大鼠的药效评价与机制研究.武汉:中南民族大学:.贺梦云.基于药代动力学研究黄连丸治疗 型糖尿病的配伍.长沙:湖南师范大学:.冶岱蔚.千金黄连丸及其拆方治疗 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