姜酮通过激活Nrf2_HO-1信号通路减轻OGD_R后氧化应激损伤对HT22细胞凋亡的抑制作用.pdf
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1、第 50 卷 第 1 期2024年 1 月吉林大学学报(医学版)Journal of Jilin University(Medicine Edition)Vol.50 No.1Jan.2024DOI:10.13481/j.1671587X.20240112姜酮通过激活 Nrf2/HO-1信号通路减轻 OGD/R后氧化应激损伤对 HT22细胞凋亡的抑制作用侯玮琛1,张桂美1,张舒石2(1.吉林大学第一医院神经内科与神经科学中心,吉林 长春 130021;2.吉林省长春市人民医院伽马刀中心,吉林 长春 130051)摘要 目的目的:探讨姜酮对氧糖剥夺/复糖复氧(OGD/R)后小鼠海马神经元 HT2
2、2细胞的保护作用,阐明其相关作用机制。方法方法:培养 HT22细胞,设置不同 OGD/R时间梯度,建立 OGD/R细胞损伤模型。HT22细胞分为对照组、OGD/R组、OGD/R1 mol L1姜酮组、OGD/R10 mol L1姜酮、OGD/R100 mol L1姜酮组和 OGD/R+0.2%二甲亚枫(DMSO)组,CCK-8 法检测各组细胞活性并计算各组细胞存活率,确定姜酮最适药物浓度。细胞分为对照组、OGD/R 组、OGD/R+姜酮组和 OGD/R+姜酮+核因子 E2相关因子 2(Nrf2)抑制剂(ML385)组,OGD/R+姜酮组细胞经姜酮给药处理 4 h后予以 OGD 8 h和复糖复氧
3、 8 h 处理,OGD/R+姜酮+ML385组细胞在姜酮给药前予以10 mol L1 ML385 预处理 6 h,CCK-8 法检测各组细胞活性,Western blotting 法检测各组细胞中Nrf2、血红素加氧酶 1(HO-1)、B 细胞淋巴瘤 2(Bcl-2)和 Bcl-2相关 X 蛋白(Bax)蛋白表达水平,酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测各组细胞培养上清中超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)水平。结果结果:与对照组比较,HT22 细胞经 OGD 8 h 和复糖复糖 8 h 处理后细胞存活率低于50%,以 OGD 8 h和复糖复糖 8 h建立 HT22细胞 OGD/R模
4、型。与 OGD/R组比较,OGD/R+不同剂量姜酮组细胞存活率均不同程度升高,其中 OGD/R+100 molL 1姜 酮 组 细 胞 存 活 率 升 高 最 明显(P0.01),故选用 100 mol L1姜酮用于后续实验。与对照组比较,OGD/R 组细胞活性明显降低(P0.01),细胞中 Nrf2、HO-1和 Bax蛋白表达水平明显升高(P0.01),Bcl-2蛋白表达水平明显降低(P0.05),细胞培养上清中 SOD 活性明显降低(P0.01),MDA 水平明显升高(P0.01);与 OGD/R 组比较,OGD/R+姜酮组细胞活性明显升高(P0.01),细胞中 Nrf2、HO-1 和Bc
5、l-2 蛋白表达水平明显升高(P0.05 或 P0.01),Bax 蛋白表达水平明显降低(P0.05),细胞培养上清中 SOD 活性明显升高(P0.01),MDA 水平明显降低(P0.01);与 OGD/R+姜酮组比较,OGD/R+姜酮+ML385组细胞活性明显降低(P0.01),细胞中 Nrf2、HO-1和 Bcl-2蛋白表达水平明显降低(P0.01),Bax 蛋白表达水平明显升高(P0.01),细胞培养上清中 SOD 活性明显降低(P0.01),MDA 水平明显升高(P0.05)。结论结论:姜酮可通过激活 Nrf2/HO-1信号通路减轻OGD/R后氧化应激损伤对 HT22细胞凋亡的抑制作用
6、。关键词 姜酮;糖氧剥夺;HT22神经元;核因子 E2相关因子 2;血红素加氧酶 1;氧化应激;细胞凋亡中图分类号 R743.3文献标志码 A文章编号 1671587X(2024)01009709收稿日期 20230226基金项目 吉林省科技厅医疗卫生人才专项项目(JLSWSRCZX2021-045)作者简介 侯玮琛(1987),女,河北省石家庄市人,主治医师,医学博士,主要从事神经内科基础和临床方面的研究。通信作者 张舒石,副主任医师(E-mail:)97第 50 卷 第 1 期 2024 年 1 月吉林大学学报(医学版)Inhibitory effect of gingerone on a
7、poptosis of HT22 cells by alleviation oxidative stress damage after OGD/R through activating Nrf2/HO-1 signaling pathway HOU Weichen1,ZHANG Guimei1,ZHANG Shushi2(1.Department of Neurology and Neuroscience Center,First Hospital,Jilin University,Changchun 130021,China;2.Center of Gamma Knife,People s
8、Hospital,Changchun City,Jilin Province,Changchun 130051,China)ABSTRACT Objective:To discuss the protective effect of gingerone on the hippocampal neuron HT22 cells after oxygen-glucose deprivation/reoxygenation(OGD/R),and to clarify the related mechanism.Methods:The HT22 cells were cultured,and the
9、OGD/R cell injury model was established by setting the gradient of OGD/R time.The HT22 cells were divided into control group,OGD/R group,OGD/R+1 mol L1 gingerone group,OGD/R+10 mol L1 gingerone group,OGD/R+100 mol L1 gingerone group,and OGD/R+0.2%dimethyl sulfoxide(DMSO)group.The viability of the ce
10、lls in various groups was detected by CCK-8 assay;the survival rates of the cells in various groups were calculated to determine the optimal drug concentration of gingerone.The cells were divided into control,OGD/R group,OGD/R+gingerone,and OGD/R+gingerone+nuclear factor erythroid-2-related factor 2
11、(Nrf2)inhibitor(ML385)groups.The cells in OGD/R+gingerone group were treated with gingerone for 4 h before OGD treatment for 8 h followed by reoxygenation for 8 h,and the cells in OGD/R+gingerone+ML385 group were treated with 10 mol L1 ML385 for 6 h before gingerone treatment.The viability of the ce
12、lls in various groups was detected by CCK-8 assay;the expression levels of Nrf2,heme oxygenase-1(HO-1),B-cell lymphoma-2(Bcl-2),and Bcl-2-associated X protein(Bax)proteins in the cells in various groups were detected by Western blotting method;the activity of superoxide dismutase(SOD)and the level o
13、f malondialdehyde(MDA)in the cell culture supernatant in various groups were detected by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)method.Results:Compared with control group,the survival rate of the HT22 cells was below 50%after treated with OGD for 8 h and reoxygenation for 8 h,so the HT22 cell OGD/R
14、 model was established by treated with OGD for 8 h and reoxygenation for 8 h.Compared with OGD/R group,the survival rates of the cells in OGD/R+different doses of gingerone groups were increased to various extents,and the survival rate of the cells in OGD/R+100 mol L1 gingerone group was significant
15、ly increased(P0.01);so 100 mol L1 gingerone was used for the subsequent experiment.Compared with control group,the viability of the cells in OGD/R group was significantly decreased(P0.01),and the expression levels of Nrf2,HO-1,and Bax proteins in the cells were significantly increased(P0.01),while t
16、he expression level of Bcl-2 protein in the cells was significantly decreased(P0.05),and the SOD activity in the cell culture supernatant was significantly decreased(P0.01),and the level of MDA was significantly increased(P0.01);compared with OGD/R group,the viability of the cells in OGD/R+gingerone
17、 group was significantly increased(P0.01),and the expression levels of Nrf2,HO-1,and Bcl-2 proteins in the cells were significantly increased(P0.05 or P0.01),while the expression level of Bax protein in the cells was decreased(P0.05),the SOD activity in the cell culture supernatant was significantly
18、 increased(P0.01),and the level of MDA was significantly decreased(P0.01);compared with OGD/R+gingerone group,the viability of the cells in OGD/R+gingerone+ML385 group was significantly decreased(P0.01),and the expression levels of Nrf2,HO-1,and Bcl-2 proteins were significantly decreased(P0.01),whi
19、le the 98侯玮琛,等.姜酮通过激活 Nrf2/HO1信号通路减轻 OGD/R后氧化应激损伤对 HT22细胞凋亡expression level of Bax protein in the cells was significantly increased(P0.01),the SOD activity in the cell culture supernatant was significantly decreased(P0.01),and the level of MDA was significantly increased(P0.05).Conclusion:Gingerone
20、alleviates the oxidative stress damage,and thereby plays an inhibiory effect on the apoptosis of the HT22 neurons by activating the Nrf2/HO-1 signaling pathway after OGD/R.KEYWORDS Gingerone;Oxygen-glucose deprivation;HT22 neuron;Nuclear factor erythroid-2-related factor 2;Heme oxygenase 1;Oxidative
21、 stress;Apoptosis缺血性脑卒中是指由于脑动脉狭窄或闭塞和脑供血不足导致的脑组织坏死,是一种急性脑血管疾病,其患病率、致残率、死亡率和复发率均较高1。目前,通过在时间窗内及时进行药物溶栓或机械取栓以实现血管再通和急性期改善侧支循环是治疗缺血性脑卒中最关键和最有效的方法。但上述治疗在改善脑缺血半暗带区组织灌注的同时也会造成难以避免的继发性神经损伤,即脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia-reperfusion injury,CIRI)2。CIRI是缺血性脑卒中后继发性脑损伤的主要原因,可加剧氧化应激损伤、炎症反应和组织水肿等后续病理改变。CIRI 是涉及多层次、多通
22、路和多靶点的复杂瀑布式级联化学损伤过程,发病机制非常复杂,其中氧化应激损伤是重要机制之一3。核因子 E2 相关因子 2(nuclear factor erythroid-2-related factor 2,Nrf2)是重要的内源性氧化应激调节因子,通过与抗 氧 化 反 应 元 件(antioxiolant response element,ARE)结合调节编码抗氧化蛋白的表达,包括超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和血红素加氧酶 1(heme oxygenase-1,HO-1)等,抑制活性氧(reactive oxygen species,ROS)的过度产生4
23、。因此,调控 Nrf2/HO-1信号通路可能在调控缺血性脑卒中后细胞氧化与抗氧化平衡中发挥重要作用。生姜是姜科植物姜的根茎,是一种广泛使用的食品成分,在传统医学中经常被用来治疗各种病症,包括感冒、恶心、哮喘、出血和肌肉疼痛5-6。此外,生姜还用于癌症、骨病、代谢功能障碍和血管疾病的治疗7-8。生姜的主要成分包括姜酚、姜酮、姜烯酚和姜酮酚等,由于上述成分的构象不同,可通过靶向不同的配体位点治疗年龄相关性神经系统疾病,包括阿尔茨海默病、帕金森病和中风等8。姜酮的化学名为4-(4-羟基-3-甲氧基丙基)-2-丁酮,是一种从生姜中提取的活性酚类化合物,是生姜的关键有效成分,具有抗肿瘤、抗炎和抗氧化等多
24、种药理活性。目前关于姜酮能否改善缺血后神经功能损伤及相关分子机制尚不明确。本研究拟从细胞水平研究姜酮能否通过 Nrf2/HO-1信号通路减轻氧化应激损伤并抑制 HT22细胞凋亡,进而发挥神经保护作用。1 材料与方法 1.1实验细胞实验细胞、主要试剂和仪器主要试剂和仪器小鼠海马神经元HT22 细胞购自中国科学院细胞库。姜酮(纯度98%,CAS 122-48-5)购自上海融禾医药科技发展有限公司。无糖 DMEM 培养基、高糖 DMEM 培养基和胎牛血清均购自美国 Gibco公司,二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)购 自 美 国 Sigma 公司,CCK-8试剂盒购自日本同
25、仁化学研究所,蛋白定量试剂盒和超敏 ECL 化学发光试剂盒购自美国Thermo公司,核蛋白抽提试剂盒购自美国 Solarbio公 司,Nrf2、HO-1、B 细 胞 淋 巴 瘤 2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2 相 关 X 蛋 白(Bcl-2 associated X protein,Bax)和 GAPDH 抗体均购自美国 Abcam 公司,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶 电 泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)预 制 胶 和 SDS-PAGE 上样缓冲液购自美
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