荧光分析法检测原理及应用举例.doc

1 荧光定义某些化学物质从外界吸收并储存能量而进入激发态，当其从激发态回到基态时，过剩的能量以电磁辐射的形式放射出去即发光，称之为荧光。可产生荧光的分子或原子在接受能量后引起发光，供能一旦停止，荧光现象随之消失。2 荧光分类由化学反应引起的荧光称为化学荧光，由光激发引起的荧光称为光致荧光，课题主要研究光致荧光。按产生荧光的基本微粒不同，荧光可分为原子荧光、X射线荧光和分子荧光，课题主要研究分子荧光。3 光致荧光机理某一波长的光照射在分子上，分子对此光有吸收作用，光能量被分子所吸收，分子具有的能量使分子的能级由最低的基态能级上升至较高的各个激发态的不同振动能级，称为跃迁。分子在各个激发态处于不稳定的状态，并随时在激发态的不同振动能级下降至基态，在下降过程中，分子产生发光现象，此过程为释放能量的过程，即为光致荧光的机理。光致荧光的过程按照时间顺序可分为以下几部分。3.1 分子受激发过程 在波长为10400nm的紫外区或390780nm的可见光区，光具有较高的能量，当某一特征波长的光照射分子时，是的分子会吸收此特征波长的光能量，能量由光传递到分子上，此过程为分子受激发过程。分子中的电子会出现跃迁过程，在稳定的基态向不稳定的激发态跃迁。跃迁所需要的能量为跃迁前后两个能级的能量差，即为吸收光的能量。分子跃迁至不稳定的激发态中即为电子激发态分子。在电子激发态中，存在多重态。多重态表示为2S+1。S为0或1，它表示电子在自转过程中，具有的角动量的代数和。S=0表示所有电子自旋的角动量代数和为0，即所有电子都是自旋配对的，那么2S+1=1，电子所处的激发态为单重态，用Si表示，由此可推出，S0即为基态的单重态，S1为第一跃迁能级激发态的单重态，S2为第二跃迁能级激发态的单重态。S=1表示电子的自旋方向不能配对，说明电子在跃迁过程中自旋方向有变化，存在不配对的电子为2个，2S+1=3，电子在激发态中位于第三振动能级，称为三重态，用Ti来表示，T1即为第一激发态中的三重态，T2即为第二激发态中的三重态，以此类推。分子跃迁至各个激发态中，状态不稳定，随时会释放出能量，释放能量的类型有两种：一种是辐射跃迁，另一种是非辐射跃迁，释放能量会回到稳定的基态。图1表示激发态的分子释放能量的过程。图1 分子释放能量方式3.2 分子的辐射跃迁过程处于不稳定激发态的分子会跃迁至能量较低的能级，释放能量，如图2为激发和发射能级跃迁图。辐射跃迁的过程会发出荧光或磷光。荧光过程（F）：当分子在激发态跃迁至此激发态的最低振动能级后，仍不稳定，继续跃迁至第一激发态的最低振动能级，并伴随着振动弛豫和能转换的发生。到达第一激发态的最低振动能级，进而再跃迁至基态，并伴随着能量辐射，此辐射光即为荧光。图2中F表示荧光辐射。由于分子在较高的能级跃迁至第一激发态的最低振动能级时，消耗能量，因此，分子跃迁至基态发出荧光，能量小于激发态的能量。荧光的发射波长大于荧光激发光的波长。磷光过程（P）：如果分子在较高激发态释放能量跃迁至第一激发态的最低振动能级，并没有继续跃迁至基态的不同振动能级，而是系间跨越至此激发态的一个三重态，从三重态跃迁至基态的各个不同振动能级，发出磷光，如图2中的P过程。由于系间跨越消耗一定的能量，因此磷光发出的能量要小于荧光发出的能量，磷光具有比荧光长的发射光谱。3.3 分子的非辐射跃迁过程处于不同激发态的分子，并不是所有的都进行辐射跃迁，有些过程属于非辐射跃迁，如：系间跨越、各个激发态之间的内转换与外转换、激发态内部的振动弛豫。系间跨越（ISC）：表示分子在激发态的单重态跃迁至此激发态相同能级的三重态，发生的原因为电子的自旋角动量之和不等于0，系间跨越导致发射的荧光强度非常微弱。并不是所有的分子都会发生系间跨越，一些物质分子中含有质量较重的原子，或分子中含有顺磁性物质（如氧分子），容易发生系间跨越。图2中ISC为系间跨越过程。内转换（IC）：表示分子从某一激发态的最低振动能级跃迁至下一个激发态的最高振动能级，并释放能量的过程。由于跃迁前后的两个能级能量差别较小，因此内转换过程释放的能量较少，图2中IC为内转换过程。外转换：表示溶液中的溶质分子在运动过程中与其他物质碰撞，碰撞过程使得溶质分子具有的能量降低，外转换出现于溶质分子由第一激发态的最低振动能级向基态的最高振动能级跃迁的过程，导致发射的荧光或磷光强度衰减或猝灭。振动弛豫（VR）：表示处于激发态的溶质分子，在运动过程中与其他介质的分子相互碰撞，将能量传递给介质分子，并跃迁至相同激发态的最低振动能级。图2中VR为振动弛豫过程。图2 分子能级跃迁示意图4 影响荧光强度的因素4.1 分子内部因素对荧光强度的影响有机物的种类繁多，并不是所有的有机物都具有光致荧光效应。具有发射荧光特性的有机物，其分子结构比较特殊，在紫外-可见光范围内能够对激发光有吸收作用，而且物质分子具有发射荧光的量子效率，即量子产率。4.1.1 量子产率荧光物质的量子产率表示其发射荧光的能力，分子的量子产率越高，发射荧光的能力就越强。量子产率的定义为：在激发光作用下，物质发射荧光的光子数与所吸收的激发光的光子数之比F：（1）式中F量子产率； NF发射的荧光光子数；NA吸收的激发光光子数。分子在激发光的照射下，吸收光能量，跃迁至激发态，并回到基态发出荧光，分子回到基态的过程分为辐射跃迁和非辐射跃迁返回两种形式。用辐射跃迁和非辐射跃迁的分子数来表示荧光量子产率，可以表示为：（2）由式2可知，荧光的量子产率与分子的非辐射过程和辐射过程有关。当辐射过程的荧光常数越大时，荧光量子产率越大；当非辐射过程的跃迁速率越大时，荧光量子产率越小。有光致荧光的原理可知，荧光量子产率总是小于1，物质的荧光量子产率越大，说明有更多的分子参与辐射跃迁，发出的荧光强度就越强。4.1.2 分子结构分子在基态吸收光能量，跃迁到激发态时，返回基态的形式有三种：辐射跃迁、非辐射跃迁以及光化学反应。这三种过程中，速率常数较大的途径起主要作用。当辐射跃迁中荧光发射阶段的速率常数大于另外两种途径时，物质分子发出的荧光强度比较大。分子发射荧光的强度与分子结构密切相关，主要体现在：（1）分子的结构含有后共轭的双键。共轭组分越大，双键电子越容易被激发。绝大多数的荧光类物质都具有环状结构，荧光峰值与环的结构有关，环的结构越大，峰值越容易出现红移，荧光峰值也越高。当环的总数相同，但结构不同时，呈线性的环，分子的荧光峰值要大于呈非线性的。（2）能产生荧光的物质分子结构为刚性平面结构。平面的结构有利于分子的稳定性，不易于外界环境的其他分子发生碰撞，避免了荧光猝灭。（3）荧光物质分子的结构中，取代基团为给电子取代基。这种结构有助于荧光峰值出现红移，使得荧光强度增强。（4）分子的跃迁发生在紫外-可见光区，即为*型跃迁，这种跃迁具有较高的荧光强度。4.2 环境因素对荧光强度的影响影响荧光强度的环境因素主要包括溶剂、PH 值和温度不同时的影响以及有序介质和测量激发光源的不同等等，具体影响及产生原因如下所述。4.2.1 溶剂性质的影响由于溶剂分子和溶质分子间存在静电作用，并且溶质分子具有不同的偶极、极化率，在混合溶液中荧光体分子与溶剂分子间的相互作用程度不同将会造成其光谱产生很大变化，即使光谱图像发生Stokes 位移。由于不同溶剂对荧光体的光谱图有着不同的影响，所以为了能够更好的实验检测，需要针对不同的被测物质选择适当的溶剂。4.2.2 PH 值的影响溶液酸碱性对荧光体荧光特性的影响主要是由于氢键造成的，当被测物是具有-H键或-OH键的有机物质时，在PH值不同时，-H键或-OH键会与其他分子发生反应形成复合物从而使荧光强度发生改变进而影响物质的荧光光谱。氢键的影响有两种情况：一种是吸收光谱和荧光光谱都受影响，这是因为氢键配合物的产生是在激发之前；另一种情况是只有荧光光谱受影响，这是因为氢键配合物的产生在激发之后。4.2.3 温度的影响通常情况下，溶液的荧光量子产率和荧光强度与温度的变化都成反比关系，这主要是由于溶液中介质的黏度的变化引起的，当温度升高时会引起黏度的减小从而造成溶液溶剂分子与周围环境发生碰撞的几率和频率变大，分子通过其他形式释放能量，这样产生的荧光效应就会变弱；随着温度的降低，溶液溶剂分子与周围环境发生碰撞的几率变小，分子能量以荧光形式释放的几率变大，此时荧光效应变强。所以在实验时，应当保持室内温度的恒定，使测量结果稳定。4.2.4 有序介质的影响常见的有序介质有表面活性剂或者环糊精溶液等等，将其加入到溶液当中后将对物质的荧光特性产生非常明显的影响。表面活性剂两端的粒子性质截然不同，一端具有极强的亲水性，一端具有极强的厌水性，因此加入活性剂的溶液不管是水还是油性溶剂都能够降低表面张力和表面自由能，使溶质易溶于溶液。表面活性剂一般是非光活性物质，毒性小，价格便宜，实用方便。目前胶束溶液主要用来提高测定的灵敏度。环糊精与表面活性剂相似，其分子结构中存在一个亲水的外缘和一个疏水的空腔，空腔能够与许多有机物结合形成稳定性特别好的主客体包合物，使荧光强度增强，故其得到了广泛的应用。4.2.5 激发光源的影响激发光源对荧光光谱的影响作用主要是由激发光源的波长和强度不同所造成的。由于物质对光的吸收具有选择性，当激发物质的激发波长发生细小改变时很可能引起荧光效率的巨大改变；而当激发光的能量大于某一临界值时，可能引起某些荧光物质发生的光化学反应如光解变化，化学变化一旦发生就是不可逆的，并且改变了分子的结构，所以荧光光谱也会随之改变，荧光强度随光照射时间增加而逐渐下降，尤其对于浓度非常小的溶液来说，光化学分解所造成的影响尤其严重尤其是有毒化合物发生光化学分解后的产物还是有毒的。因此，进行荧光测量时应当针对不同的被测物选择不同大小的狭缝来改变摄入的激发光强。5 荧光强度与溶液浓度的关系朗伯-比尔定律(Beer-Lambert law)，是光吸收的基本定律，也是利用光谱进行物质浓度测量的理论基础，包括朗伯关系定律和比尔关系定律。朗伯关系定律是对于物质对光的吸收程度和吸收介质厚度之间的关系的阐述，即在激发光的波长和被测荧光体的浓度不变的情况下，光的吸收强度只与它的光程长度成正比。比尔关系定律是指在介质厚度和激发光波长保持不变时，光的吸收强度与浓度成正比。朗伯-比尔定律具体可表示为当一束单色光照射到吸收介质表面上，在通过一定厚度的介质后，由于介质吸收了一部分光能，透射光的强度就要减弱。吸收介质的浓度愈大，介质的厚度愈大，则光强度的减弱愈显著，其数学表达式为：（3）（4）式中，A是吸光度；It、I0为透射光和入射光强度；c为吸光物质的浓度；为摩尔吸光系数；l为透射光程。溶液的荧光发射强度是由荧光物质的荧光效率、溶液的吸光程度和液层厚度共同决定的。但是朗伯-比尔定律并不适用于所有范围内浓度的测定，在特定频率特定光强的照射下，只有当溶液浓度很稀时，物质的浓度与其产生的荧光强度才近似成正比关系，可以应用下面的朗伯-比尔定律的线性表达式：（5）当cl0.05时，则荧光强度与溶液的浓度不成线性关系，此时应该考虑幂级数中的二次方甚至三次方等高次项。这一现象主要是由于浓度效应造成的，而浓度效应除了受到内滤效应的影响外，还受到激发态分子与其他状态分子形成的二聚合物或复合物有关，二聚合物或复合物能够引起光谱的改变或强度的下降。6 荧光分析方法分类及优点6.1 同步荧光分析（Synchronous Fluorescence Analysis）与常用荧光测定方法最大的不同就是同步扫描激发和发射两个单色器的波长，由测得荧光强度信号与对应的激发(发射)波长构成光谱图。根据激发和发射波长在荧光同步检测中保持关系的不同可以将同步荧光分析分为四种不同的类型，即恒波长同步、恒能量同步、可变角(或可变波长)同步和恒基体同步荧光法。除了较高的灵敏度外，同步荧光法的优点主要有简化谱图、窄化谱带、减少光谱重叠、提高选择性和减少散射干扰等等。6.2 三维荧光光谱（Three Dimensional Fluorescence Spectrum，TDFS）是一种新型的荧光分析技术，由于获取手段和视角不同，其具有不同的命名，常见的有三维荧光光谱、总发光光谱以及激发发射矩阵和等高线光谱等等。与普通的荧光分析法的不同主要是其能够获得激发波长与发射波长同时变化时的荧光强度信息。6.3 时间分辨荧光分析（Time-resolved Fluorescence Analysis）是指在物质受激发后不是立即检测，而是过段时间后再荧光检测，这样就可检测出荧光寿命不同的物质，这主要是由于不同荧光物质的荧光寿命不同所造成的。利用脉冲法测量荧光寿命主要可用脉冲取样法和光子计数法两种，在适当的激发光源和检测系统中，可以得到在固定波长的荧光强度时间曲线和在固定时间的荧光发射光谱，可以用来实现那些混合物中荧光光谱重叠严重但其荧光寿命差异明显的组分之间的辨别测定；可以消除杂质和背景荧光来提高信噪比，同时也用于溶剂弛豫时间测量和自由基的存在检测等方面。6.4 导数荧光分析方法（The Derivative Fluorescence Analysis）由于在室温条件下，矿物油光谱的谱带普遍较宽，在其混合物的光谱图中，导数光谱技术的引入可以很好地解决谱带具有严重的重叠现象的问题。导数光谱具有大大减小光谱干扰、增强特征光谱的精细结构的分辨能力和区分光谱的细微变化等优点，但同时也存在信噪比降低的缺点。导数光谱在进行定量测定时，其求值方法主要有基线法、峰距法和峰零法等等。7 数据处理分析方法7.1 主成分分析法（PCA）是一种数学变换的方法, 它把给定的一组相关变量通过线性变换转成另一组不相关的变量，这些新的变量按照方差依次递减的顺序排列。在数学变换中保持变量的总方差不变，使第一变量具有最大的方差，称为第一主成分，第二变量的方差次大，并且和第一变量不相关，称为第二主成分，依次类推。是希望用较少的变量去解释原来数据中的大部分变量，将许多相关性很高的变量转化成彼此相互独立或不相关的变量。通常是选出比原始变量个数少，能解释大部分数据中变量的几个新变量，即所谓主成分，并用以解释资料的综合性指标。由此可见，主成分分析实际上是一种降维方法。7.2 BP神经网络算法是一种按误差逆传播算法训练的多层前馈网络，BP网络能学习和存贮大量的输入-输出模式映射关系，而无需事前揭示描述这种映射关系的数学方程。它的学习规则是使用最速下降法，通过反向传播来不断调整网络的权值和阈值，使网络的误差平方和最小。BP神经网络模型拓扑结构包括输入层(input)、隐层(hide layer)和输出层(output layer)。7.3 逐步回归分析法基本思想是将变量逐个引入模型，每引入一个解释变量后都要进行F检验，并对已经选入的解释变量逐个进行t检验，当原来引入的解释变量由于后面解释变量的引入变得不再显著时，则将其删除。以确保每次引入新的变量之前回归方程中只包含显著性变量。这是一个反复的过程，直到既没有显著的解释变量选入回归方程，也没有不显著的解释变量从回归方程中剔除为止。以保证最后所得到的解释变量集是最优的。8 荧光法检测矿物油的可行性分析由关于荧光产生机理的分析研究可知，荧光能否产生与物质分子的结构之间存在着密切的关系，即物质的分子结构决定着其产生的激发光谱、发射光谱以及相对应的荧光强度。结合前面内容，可知物质能否发出荧光和利用荧光来进行测量必须满足以下条件：第一，物质能够产生荧光，这要求物质发光内部要具有光吸收的结构，在受到光照射时可以吸收光能。通常情况下，能发出荧光的有机物主要是某种有机试剂或金属离子与脂肪族有机化合物之间形成的配合物或者是芳香族化合物等，这类化合物能够发出荧光主要是由于其吸光特性因其分子的价电子的重新排列(即跃迁)而得到了增强。第二，较高的荧光量子产率，这是因为无法定量定性地对产率过低的荧光物质进行光谱分析。在已知的众多的有机物中，仅有一小部分具有较高的荧光产率。通过对其分子结构的分析可知，在具备下列分子结构特点时，物质才能发出强荧光。(1)具有大的共轭键结构；(2)具有刚性的平面结构；(3)取代基团为供电子取代基；(4)具有较低的单线电子激发态S1为*型。这样的分子结构有助于产生的较高荧光量子产率的主要解释如下。(1)一般能够发生荧光的物质的分子都含有共轭双键键体系。共轭键的存在能够增大荧光物质的摩尔吸光系数，使其分子更容易被激发从而发生荧光。而且在能够发出荧光的物质中大都含有芳环或杂环结构，芳环的存在是荧光发生红移的原因。(2)当物质分子具有刚性平面结构时，分子之间的振动将会减小，使溶剂和溶质分子之间的相互作用减小，可以减少激发态分子的非辐射跃迁几率，因而增加荧光产率。(3)取代基有给电子基团和吸电子基团两种，给电子基团如-OH、-OR、-CN等由于增强了电子的共轭程度可使荧光增强；吸电子基团如-COOH、-NO等可以减弱甚至猝灭荧光。所以取代基的性质不同对物质的荧光产率有着明显不同。(4)第一电子激发态S1是*型，不含杂质原子(N、O、S等)的有机荧光体均属于这一类，由到*的跃迁属于电子的自旋允许跃迁，与其他跃迁类型的摩尔吸光系数相比，其摩尔吸光系数要大的多。第三，有利的外部实验环境条件，知道不仅分子的结构能够影响物质分子荧光的产生和荧光量子产率的高低，外界工作条件如PH值、温度、溶剂的选择等等的改变都会导致荧光体的分子结构和荧光特性的变化。而要研究的矿物油恰恰满足以上要求，即矿物油主要是包括碳氢元素形成的烃类和非烃类构成，其中在能够产生荧光的物质中，共轭双键化合物和芳香族化合物占有主导地位，这些化合物都具有不饱和键结构，具有很强的荧光特性。并且针对于本文要检测研究的汽煤柴三种矿物油来说，它们本身在组成上含有的C原子多少就不同，即具有芳环或者杂环的个数有着明显的区别，即在激发光源相同的情况下，矿物油的荧光光谱的荧光强度及波形形状等荧光特性都是因油种的不同而有明显差异，这就是矿物油能够进行荧光测量的理论依据。 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