近端小管RAS功能轴在早期糖尿病小鼠肾脏中的变化.pdf
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1、中国病理生理杂志 Chinese Journal of Pathophysiology 2023,39(8):1373-1382杂志网址:http:/近端小管RAS功能轴在早期糖尿病小鼠肾脏中的变化*虎璇1,杨一菲1,韦忠平1,John S.D.CHAN2,苏可1,21武汉大学人民医院肾内科,湖北 武汉430060;2蒙特利尔大学医院研究中心(CRCHUM),加拿大 魁北克省 蒙特利尔市 H2X 0A9摘要 目的:观察自发性糖尿病小鼠模型中,糖尿病肾病早期近端小管肾素-血管紧张素系统(RAS)两条轴 血管紧张素转换酶(ACE)-血管紧张素II(Ang II)-血管紧张素II 1型受体(AT1)
2、经典轴和ACE2-Ang(1-7)-Mas受体(MasR)新轴 的变化特征及对肾脏结构和功能的影响。方法:应用雄性自发性1型糖尿病Akita小鼠(以C57BL/6背景的雄性非糖尿病小鼠为正常对照)和自发性2型糖尿病db/db小鼠(以C57BLKS/J背景的雄性db/m非糖尿病小鼠为正常对照),饲养至16周龄时处死小鼠,测定相应生理指标。收集尿液,检测尿液中Ang II和Ang(1-7)的含量;收取肾脏组织行病理切片染色观察肾脏结构变化;免疫组化法观察肾脏组织血管紧张素原(Agt)、ACE、ACE2和MasR的表达部位及变化;Western blot和RT-qPCR测定近端肾小管的上述蛋白及mR
3、NA的变化。结果:两种糖尿病小鼠16周龄时,肾小球滤过率和尿白蛋白/肌酐比值显著增加(P0.05),PAS染色可见近端肾小管细胞体积增加,管腔扩张,肾小管肥大,肾小管损伤分数显著增加(P0.01)。RAS成分检测结果显示,与对照组相比,糖尿病小鼠近端小管Agt和ACE2的蛋白和mRNA表达水平显著升高(P0.01),尿Ang II排泄显著增加(P0.01),而ACE和MasR的蛋白和mRNA表达水平显著下调(P0.01),尿Ang(1-7)含量显著减少(P0.01)。结论:在自发性糖尿病小鼠中,近端小管RAS在糖尿病肾病早期被激活,激活的RAS可能参与糖尿病肾病早期肾小球高滤过、肾小球和肾小管
4、肥大及近端小管损伤。关键词 肾素-血管紧张素系统;近端肾小管;糖尿病肾病;自发性糖尿病小鼠中图分类号 R587.2;R363 文献标志码 A doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2023.08.004Changes of RAS in mouse proximal tubules in early stage of diabetic kidney diseaseHU Xuan1,YANG Yifei1,WEI Zhongping1,John S.D.CHAN2,SU Ke1,21Department of Nephrology,Renmin Hospital of Wuh
5、an University,Wuhan 430060,China;2University of Montreal Hospital Research Centre(CRCHUM),Quebec H2X 0A9,Canada.E-mail:ABSTRACT AIM:To observe the changes of renin-angiotensin system(RAS),including the angiotensin-converting enzyme(ACE)-angiotensin II(Ang II)-Ang II type 1 receptor(AT1)classic axis
6、and the ACE2-Ang(1-7)-Mas receptor(MasR)new axis,in the proximal tubule of diabetic mice,and their effects on kidney structure and function in the early stage of diabetic kidney disease(DKD).METHODS:Male spontaneous type 1 diabetic Akita mice and type 2 diabetic db/db mice were used,and male nondiab
7、etic mice with C57BL/6 background and db/m nondiabetic mice with C57BLKS/J background were used as controls,respectively.At 16 weeks of age,the mice were sacrificed to measure corresponding physiological parameters.Urine was collected,and the levels of Ang II and Ang(1-7)were measured by ELISA.Kidne
8、y tissue was collected for pathological section staining to evaluate morphological changes in kidney structure.Immunohistochemistry was used to observe the localization and changes of angiotensinogen(Agt),ACE,ACE2 and MasR in kidney tissues.Western blot and RT-qPCR were used to measure the changes o
9、f these proteins and mRNA in isolated proximal renal tubules.RESULTS:The glomerular filtration rate,urinary albumin/creatinine ratio,proximal tubular cell vol文章编号 1000-4718(2023)08-1373-10 收稿日期 2023-02-10 修回日期 2023-05-28*基金项目 国家自然科学基金资助项目(No.81700559);湖北省自然科学基金资助项目(No.2021CFB360);Canadian Institutes
10、 of Health Research(PJ9-179813 to JSDC)通讯作者 Tel:18627108794;E-mail:1373ume,tubular luminal dilation,tubular hypertrophy and tubular injury score were increased in type 1 and type 2 diabetic mice(P0.05).The Agt and ACE2 expression levels were increased in proximal tubules of diabetic mice compared wi
11、th control mice(P0.01),while the ACE and MasR expression levels in proximal tubules of diabetic mice were lower than those in control mice(P0.01).Urinary Ang II excretion was increased,while urinary Ang(1-7)level was decreased in these 2 types of diabetic mice compared with control mice(P0.01).CONCL
12、USION:The proximal tubular RAS in spontaneously diabetic mice is activated in the early stage of DKD.Activation of RAS leads to glomerular hyperfiltration,glomerular and tubular hypertrophy,and proximal tubular injury in the early stage of DKD.KEY WORDS renin-angiotensin system;proximal tubule;diabe
13、tic kidney disease;spontaneously diabetic mice糖尿病肾病(diabetic kidney disease,DKD)是终末期肾脏疾病的主要病因之一。肾素-血管紧张素系 统(renin-angiotensin system,RAS)过 度 激 活 是DKD进展的重要机制之一1。肾脏在DKD发生发展过程中不仅受到全身RAS的影响,还受到肾脏局部RAS的影响。大量证据表明,DKD肾脏局部激活的RAS可改变肾脏的血流动力学,改变细胞表型、引起细胞增殖,调节多种生物活性物质(血管活性激素等)的基因表达,并激活成纤维细胞、内皮细胞、系膜细胞等多种细胞内的信号传导
14、通路2,从而促进DKD的进展。RAS系统包括两条相互抗衡的轴,一条是血管紧张素转换酶(angiotensin-converting enzyme,ACE)-血管紧张素 II(angiotensin II,Ang II)-血管紧张素II 1型受体(Ang II type 1 receptor,AT1)经典轴,主导促血管收缩、水钠潴留、氧化应激、炎症和纤维化、细胞增殖等作用。另一条血管紧张素转换酶2(angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)-血管紧张素(1-7)angiotensin(1-7),Ang(1-7)-Mas受体(Mas receptor,MasR)轴能
15、对抗RAS经典轴的作用,发挥舒张血管、抗纤维化和利尿、降低氧化应激、抗细胞增殖的作用,保护肾脏免于损伤3。这两条相互对抗的轴之间的平衡决定了肾脏结局最终走向。既往研究显示,DKD患者肾活检标本中肾小球和肾小管中ACE2表达下调、ACE表达上调,且与肾小球滤过率呈负相关4。那么在DKD的早期肾脏中ACE和ACE2介导的RAS两大功能轴如何变化?本研究应用自发性1型糖尿病Akita小鼠和自发性2型糖尿病db/db小鼠5-6,观察在DKD早期阶段,近端肾小管RAS成分的变化,旨在揭示肾小管 ACE-Ang II-AT1和ACE2-Ang(1-7)-MasR两条RAS轴在DKD早期的变化特征。材料和方
16、法1动物1型和2型自发性DKD小鼠模型的建立:78周龄 C57BL/6 背景的雄性 Akita 小鼠与雌性野生型(wild-type,WT)C57BL/6小鼠按1 2近交繁殖,产生子1代生长至45周龄时,经基因型鉴定和测量尾静脉随机血糖,随机血糖大于16.7 mmol/L的小鼠判定为 1 型 糖 尿 病 Akita 鼠7,同 窝 血 糖 正 常 的 WT C57BL/6小鼠为正常对照(下文用WT表示)。78周龄C57BLKS/J背景的db/m雄性和雌性小鼠按1 2近交繁殖,产生子1代生长至68周龄时观察颜色和体型,尾静脉测量随机血糖,黑色、肥胖且血糖大于16.7 mmol/L的小鼠为db/db
17、 2型糖尿病小鼠7,同窝出生黑色瘦小鼠为 db/m正常对照。本研究中糖尿病小鼠和对照组小鼠的子1代雄性小鼠用于实验。所有亲代动物均购自Jackson Laboratory,以常规饲料饲养于加拿大蒙特利尔大学医院研究中心(University of Montreal Hospital Research Centre/Centre de Recherche du Centre Hospitalier de lUniversit de Montral,CRCHUM)动物房(SPF级)。所有动物实验均经过 CRCHUM 动物伦理委员会批准并遵循动物福利原则。2主要试剂及仪器Percoll细胞分离液(C
18、ytiva);胶原酶、菊粉(inulin)-荧光素异硫氰酸酯(fluorescein isothiocyanate,FITC)和DMEM/F-12培养液(Sigma-Aldrich);透析袋MW3500 Fisherbrand 及 Autokit Glucose 葡萄糖检测试剂盒(FUJIFILM Wako);尿白蛋白 ELISA 试剂盒(Ethos Biosciences);ACE抗体(Santa Cruz);ACE2抗体(R&D);MasR 抗体(Novus Biologicals);血管紧张素原(angiotensinogen,Agt)抗体由CRCHUM的Chan Lab自制8;DAB显
19、色试剂盒(Santa Cruz);小鼠 Ang II和Ang(1-7)含量检测ELISA试剂盒(BMA Biomedicals);C18 Sep-Pak columns(Waters)。Accu-Chek Performa型血糖仪(Roche);BP-2000尾套法血压仪(Visitech Systems);Victor 3V 酶标仪(Perkin Elmer);ChemiDoc凝胶成像系统(Bio-Rad);7500型实时定量PCR仪(Applied Biosystems)。3主要方法3.1一般指标检测和标本采集糖尿病组小鼠和1374对照组小鼠(每组小鼠911只),从8周龄开始,每2周监测小
20、鼠体重、随机血糖、尾套法测量血压,至16周龄末处死小鼠。处死前2 d代谢笼收集6 h尿液标本,按照ELISA试剂盒说明书测量尿白蛋白/肌酐比值(urinary albumin/creatinine ratio,UACR)。处死前1 d禁食过夜,处死当天尾静脉注射5%inulin-FITC,注射后分别于3、7、10、15、35、55和75 min用肝素抗凝毛细管采集股静脉血,用于测量肾小球滤过率(glomerular filtration rate,GFR)9。处死后心脏采血,离心分离血清,应用Autokit Glucose检测试剂盒(葡萄糖氧化酶法)检测禁食后血清葡萄糖水平。取新鲜右肾分离近端
21、肾小管,左肾固定在福尔马林溶液中,用于形态学观察。3.2近端肾小管分离近端肾小管分离采用改良后的Percoll密度梯度分离法9-11。将立即处死的小鼠右肾取出,去除肾蒂及包膜,切碎肾皮质,1 g/L胶原酶 37 消化 45 min,100 目尼龙网过筛,在 42%Percoll分离液中用冷冻高速离心机4、27 822g离心30 min,离心后取近管底的一层即为分离纯化的近端肾小管。分离纯化的近端肾小管保存于80 冰箱用于蛋白和mRNA的检测。3.3PAS染色和肾脏病理形态学观察取已固定的小鼠肾脏制成3 m厚的石蜡切片,行PAS染色,观察小鼠肾脏组织病理形态变化。应用 Motics Images
22、 Plus 2.0软件,测量和计算平均肾小球体积、近端肾小管细胞平均体积、肾小管管腔扩张情况。平均肾小球体积大小计算方法参照Weibel-Gomez方法12,每张切片随机测量30个肾小球面积,计算公式:平均肾小球体积=肾小球面积1.51.382/1.01。近端肾小管细胞平均体积测量方法参照文献13-15,按照球体积公式V=4r3/3计算近端肾小管细胞平均体积(r指肾小管细胞从细胞核中心至细胞边缘的平均半径),每张切片测量外皮质100个肾小管细胞的体积来计算平均体积。肾小管管腔面积的测量方法参照文献13-15,每张切片测量100个近端肾小管,计算肾小管管腔面积平均值。根据肾小管扩张、萎缩、管型、
23、刷状缘脱落、基底膜增厚等指标,对肾小管损伤程度进行15分的评分16。3.4免疫组织化学染色石蜡切片脱蜡后,采用pH 6.0的柠檬酸钠微波加热修复抗原,3%H2O2封闭内源性过氧化酶,分别加入抗 Agt抗体(1 300)、ACE抗体(1 250)、ACE2抗体(1 200)和MasR抗体(1 200),4 过夜,再加生物素标记的抗IgG(1 200),DAB显色液。显微镜下观察各蛋白定位与表达并拍照,使用ImageJ软件(https:/rsb.info.nih.gov/ij)定量分析阳性染色的平均光密度。3.5尿 Ang II和 Ang(1-7)的检测方法将非糖尿病小鼠尿液 180 L 和糖尿病
24、小鼠尿液 360 L 用C18 Sep-Pak columns进行纯化,按照小鼠尿液Ang II和Ang(1-7)含量检测ELISA试剂盒说明书推荐方法进行检测,并用尿肌酐进行标化17-18。3.6Western blot实验取分离纯化的近端肾小管,加入RIPA裂解液及蛋白酶抑制剂cocktail,4 超声破碎裂解蛋白,于 4、13 800g 离心 10 min,取上清,BCA法测定总蛋白浓度。进行SDSPAGE,转膜,牛血清白蛋白封闭2 h,孵育抗 Agt抗体(1 1 000)、ACE抗体(1 500)、ACE2抗体(1 500)和actin抗体(1 10 000),4 过夜,抗室温孵育2
25、h,ECL显色,Bio-Rad ChemiDoc 凝胶成像系统曝光。应用 Image Lab软件分析处理图像。3.7RT-qPCR实验Trizol法提取分离纯化的近端肾小管总RNA,NanoDrop 2000超微量分光光度计测定RNA纯度和含量,采用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA。加入SYBR Green Mix和引物进行扩增和分析,用核糖体蛋白L13A(ribosomal protein L13A,RPL13A)进行标化,每个样本设2个复孔,采用2Ct法计算mRNA的相对表达量。Agt的上游引物序列为5-CCACGCTCTCTGGATTTATC-3,下游引物序列为 5-ACAGACAC
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