健脾清化方对肥胖小鼠血管内皮的保护作用研究.pdf
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1、Aug.2023 Vol.30 No.8 Chinese Journal of Information on TCM健脾清化方对肥胖小鼠血管内皮的保护作用研究王琳 1,刘亚华 1,韩煦1,2,金燊懿 1,陈清光1,2,陆灏1,21.上海中医药大学附属曙光医院,上海 201203;2.上海中医药大学附属曙光医院糖尿病研究所,上海 201203摘要:目的探讨健脾清化方对高脂饮食诱导的肥胖小鼠胸主动脉内皮的保护作用及可能机制。方法采用高脂饲料喂养C57BL/6小鼠12周诱导肥胖小鼠模型,将小鼠分为模型组、健脾清化方组和盐酸二甲双胍组,以正常喂养小鼠作为正常组,每组6只。给药6周后,HE染色观察小鼠胸
2、主动脉内皮结构变化,Masson染色观察胸主动脉纤维化改变,透射电镜观察胸主动脉内皮细胞超微结构,免疫组化检测胸主动脉血小板内皮细胞黏附分子-1(PECAM-1/CD31)、NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)表达。结果与正常组比较,模型组小鼠胸主动脉局部内皮细胞脱落,内膜层增厚,有泡沫样细胞聚集,局部管壁平滑肌和弹力纤维萎缩,平滑肌细胞排列紊乱,胶原纤维增加,CD31表达降低,NLRP3表达显著升高(P0.01);与模型组比较,健脾清化方组小鼠胸主动脉内皮结构基本完整,内皮细胞脱落减少,内膜及中膜胶原纤维减少,CD31表达有升高趋势,NLRP3表达显著降低(P0.01)。结论健脾
3、清化方可能通过下调NLRP3表达改善肥胖小鼠受损的血管内皮形态和超微结构,改善炎症状态,CD31可能是健脾清化方保护血管内皮结构和通透性的重要靶点。关键词:健脾清化方;血管内皮细胞;肥胖;血小板内皮细胞黏附分子-1;NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3;小鼠中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1005-5304(2023)08-0094-06DOI:10.19879/ki.1005-5304.202209180开放科学(资源服务)标识码(OSID):Study on Effects of Jianpi Qinghua Prescription on Vascular Endoth
4、elium in Obesity MiceWANG Lin1,LIU Yahua1,HAN Xu1,2,JIN Shenyi1,CHEN Qingguang1,2,LU Hao1,21.Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,Shanghai 201203,China;2.Diabetes Institute,Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medic
5、ine,Shanghai 201203,ChinaAbstract:Objective To investigate the protective effects and possible mechanism of Jianpi Qinghua Prescription on thoracic aortic endothelium in high-fat diet-induced obesity mice.Methods C57BL/6 mice were fed a high-fat diet for 12 weeks to induce obesity.The obesity mice w
6、ere then randomly divided into model group,Jianpi Qinghua Prescription group and metformin group.The mice fed a normal diet were set as the normal group,with 6 mice in each group.After 6-weeks administration,HE staining was used to observe the pathological changes of thoracic aortic endothelium,Mass
7、on staining was used to observe the fibers changes of thoracic aortic endothelium,transmission electron microscopy was used to observe the ultrastructure of endothelial cells of thoracic aorta,the expressions of CD31 and NLRP3 were detected by immunohistochemistry.Results Compared with the normal gr
8、oup,the mice in the model group showed endothelial denudation,intimal thickening,and foam cells aggregation,the smooth muscle and elastic fiber of local tube wall atrophy,and the smooth muscle cells were in disorder,the 基金项目:国家自然科学基金(82074381、81874434);上海市科委科研计划项目(21S21900700);上海市临床重点专科(shslczdzk054
9、01);上海市中医临床重点实验室(20DZ2272200);长三角中医内分泌代谢病专科联盟ZY(2021-2023)-0302;上海中医药大学科创项目(YYKC-2021-01-144)通讯作者:陆灏,E-mail:实验研究94中国中医药信息杂志2023 年 8 月第 30 卷第 8 期collagen fibers increased,the expression of CD31 decreased and the expression of NLRP3 significantly increased(P0.01).Compared with the model group,the stru
10、cture of thoracic aortic endothelium in Jianpi Qinghua Prescription group was almost intact,the endothelial cells were less stripped,the collagen fibers decreased in intima and medica layer,the expression of CD31 showed an upward trend,and the expression of NLRP3 decreased significantly(P0.01).Concl
11、usion Jianpi Qinghua Prescription can improve impaired endothelial morphology and ultrastructure of obesity mice,ameliorate the inflammatory state.CD31 protein may be an important target of Jianpi Qinghua Prescription to protect vascular endothelial structure and permeability.Keywords:Jianpi Qinghua
12、 Prescription;vascular endotheial cells;obesity;PECAM-1/CD31;NLRP3;mice肥胖是由遗传和环境共同作用导致的慢性代谢性疾病,近年来已成为全球重要公共卫生问题之一。2020年我国居民营养与慢性病状况报告显示,18岁及以上成人超重/肥胖超过半数1。肥胖是心血管疾病(cardiovascular diseases,CVD)的危险因素,肥胖人群更易出现心脏代谢异常。近年来,过度肥胖导致的血管功能障碍引起众多研究者关注2-3。中医学认为,肥胖病机为“胃强脾弱”,导致痰湿、气郁、血瘀。课题组应用健脾清化方治疗肥胖型糖尿病具有减重作用,给药6
13、周可降低肥胖小鼠体质量、脂肪含量,改善脂肪异位沉积4,且对代谢综合征患者血管内皮具有保护作用5-6,但其作用机制尚不明确。本研究以高脂饲料喂养诱导肥胖小鼠模型,观察健脾清化方对肥胖小鼠血管内皮的保护作用,并初步探讨其作用机制,为后续研究提供实验依据。1实验材料实验材料1.1动物SPF级雄性C57BL/6小鼠30只,6周龄,体质量(182)g,北京维通利华实验动物技术有限公司上海分公司提供,生产许可证号SCXK(沪)2017-0011。饲养于SPF级实验室,所有操作严格遵守上海中医药大学实验动物伦理规定,并经过伦理委员会审批(PZSHUTCM210903001)。高脂饲料,美国Research
14、Diets公司,货号D12492。1.2药物及制备健脾清化方(党参15 g,黄芪15 g,黄芩9 g,黄连3 g,黄精15 g,山药15 g,葛根15 g,鬼箭羽15 g),饮片购自上海中医药大学附属曙光医院中药房,并委托制剂科制成中药浸膏。具体方法:饮片加1 000 mL蒸馏水浸泡1 h,常规煎煮2次,每次30 min,过滤,将2次药液混合,浓缩成含原药材1.3 g/g浸膏,置于4 冰箱保存。盐酸二甲双胍片,瑞士默克雪兰诺公司,0.5 g/片,批号LTABQ 2691。将药片碾碎后溶于生理盐水,制成30 mg/mL混悬液。1.3试剂与仪器无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司,批号1000926
15、83),二甲苯(国药集团化学试剂有限公司,批号10023418),HE染液套装(武汉塞维尔,批号G1003),Masson 三色染色液(武汉塞维尔,批号G1006),中性树胶(国药集团化学试剂有限公司,批号10004160),血小板内皮细胞黏附分子-1(PECAM-1/CD31)抗体(武汉塞维尔,批号GB11063-2),NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)抗体(武汉塞维尔,批号GB11300),HRP标记山羊抗小鼠IgG(武汉塞维尔,批号GB23301),HRP标记山羊抗兔IgG(武汉塞维尔,批号GB23303),免疫组化试剂盒DAB显色剂(丹麦DAKO,批号K5007)。Nik
16、on Eclipse E100显微镜(日本尼康),Nikon DS-U3型成像系统(日本尼康),Pannoramic MIDI病理扫描仪(匈牙利3DHISTECH),Tecnai G2 spirit Bio TWIN透射电子显微镜(美国FEI),ST40台式离心机(美国 Thermo),Optima L-90K 高速离心机(美国Beckman),TD6K掌上离心机(湖南湘仪)。2实验方法实验方法2.1分组、造模及给药30只小鼠适应性喂养1周后,随机分为正常组6只和模型对照组24只,正常组予普通饲料喂养,模型对照组予高脂饲料喂养12周,以模型对照组小鼠体质量1.2倍正常组为造模成功7-9,最终成
17、模率为75%。将成模小鼠再次随机分为模型组、健脾清化方组和盐酸二甲双胍组,每组6只。健脾清化方组予健脾清化方药液(将浸膏用生理盐水配制成1.61 g/mL溶液)20.961 g/kg灌胃,盐酸二甲双胍组予盐酸二甲双胍混悬液300 mg/kg灌胃,灌胃体积0.1 mL/10 g,模型组和正常组予等体积生理盐水灌胃,1次/d,连续6周。2.2取材给药结束后,小鼠禁食12 h,3%戊巴比妥钠腹腔注射30 mg/kg麻醉,沿肋弓下缘两侧向上剪开胸腔,取胸主动脉,每只小鼠取同一部位,用于病理观察和95Aug.2023 Vol.30 No.8 Chinese Journal of Information
18、on TCM免疫组化检测,剩余组织置于液氮中,转移至-80 冰箱保存。2.3HE染色取胸主动脉环切,于4%多聚甲醛中固定24 h,梯度脱水后包埋,制作石蜡切片,常规HE染色,中性树胶封片,显微镜下观察胸主动脉结构,使用病理扫描仪扫描切片并拍照。2.4Masson染色制作石蜡切片后进行Masson染色,中性树胶封片,置于显微镜下观察胸主动脉纤维化改变,使用病理扫描仪扫描切片并拍照。2.5透射电镜观察取小鼠胸主动脉环切,固定于2.5%戊二醛,经漂洗、锇酸固定、再漂洗、脱水、包埋、切片及染色等处理后,观察胸主动脉内皮细胞超微结构。2.6免疫组化检测石蜡切片脱蜡至水,置于EDTA抗原修复缓冲液中进行抗
19、原修复,冷却后PBS洗涤3次,每次5 min,阻断内源性过氧化物酶,封闭,洗涤,加CD31一抗(1500)、NLRP3一抗(1800),4 孵育过夜,加二抗(1200),室温孵育1 h,DAB显色,苏木素复染细胞核,脱水,封片。各切片随机选取5个视野,应用Image J软件计算阳性染色面积(area)及积分光密度(IOD),结果以平均光密度(IOD/area)表示。3统计学方法统计学方法采用GraphPad Prism 8.0.2统计软件作图并进行分析。计量资料以x s表示,符合正态分布且满足方差齐性,两组间比较用t检验,多组比较用方差分析;不符合正态分布或方差不齐用Kruskal-Walli
20、s H检验。P0.05表示差异有统计学意义。4结果结果4.1健脾清化方对模型小鼠胸主动脉病理形态的影响正常组小鼠主动脉内膜表面光滑,内皮结构完整,未见泡沫细胞,未见纤维组织增生等病变,内膜及中膜弹力膜排列整齐、呈波浪状;模型组小鼠胸主动脉局部内皮细胞脱落,内膜层增厚,有泡沫样细胞聚集,局部管壁平滑肌和弹力纤维萎缩,平滑肌细胞排列紊乱,管壁明显变薄;健脾清化方组和盐酸二甲双胍组小鼠胸主动脉内皮结构基本完整,内膜层无增厚,内皮细胞脱落较少,中膜平滑肌细胞排列紊乱及萎缩情况有一定改善,且弹力膜排列较模型组整齐。见图1。4.2健脾清化方对模型小鼠胸主动脉纤维化的影响Masson染色胶原纤维呈蓝色,肌纤
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