怀牛膝多糖的提取及应用.pdf

怀牛膝是一种苋科植物牛膝的干燥根，其多糖含量较高，根呈圆柱状，茎上有棱角，植株关节部分膨胀，形状好似牛的膝盖，闻起来气味微苦，但味道微甜而稍苦涩，其主要对由湿寒引起的手足痿弱、四肢僵硬不灵活、身体关节痛而不能屈伸的顽疾，以及血气堵塞、伤热火烂等疾病有很好的疗效，长时间服用能够改善身体，减少疾病，保持身体的年轻活力，还具有滋补肝肾、强筋健骨、强壮腰膝和理气止痛、通血活络、引血气下行等功效。怀牛膝中含有多种化学成分，其中主要成分包括皂苷、甾酮类、多糖类、甜菜碱和各种微量元素1-4。而怀牛膝多糖是一种分子较小的多糖化合物，不仅能够溶于水，还有较好的稳定性，它是怀牛膝根通过提取、分离、纯化得到的一种有效物质，已引起了研究人员的广泛关注。研究显示，怀牛膝多糖是一种必不可少的药效基础物质，具有抗肿瘤、提高身体免疫力、抗凝血、抗病毒、改善骨质疏松、促进骨骼生长、抗氧化、延缓衰老等作用5-6，已成为重要的多糖药物之一，在中药临床的应用研究和中药保健品开发中都有着广阔的前景。为更高效、合理、科学地开发使用我国怀牛膝药物资源，本文将重点介绍关于怀牛膝多糖的分离提取、纯化工艺以及当今应用状况的研究。1 怀牛膝多糖的提取工艺1.1 水煮提取法植物多糖具有水溶性，水煮提取法可使植物细胞发生质壁分离，从而使怀牛膝多糖溶解在水中，并透过细胞壁散布于外界溶剂中。目前，已有许多学者对该提取工艺进行了研究，并通过设计正交实验来探究实验条件对怀牛膝多糖（ABP）得率的影响，以此探究最佳工艺条件。王媛媛等7用一定的料液比在100下，加热回流1 h进行水煮提取，进行多种因素的正交实验，探索提取过程的最佳条件。侯剑萍等8通过实验进一步优化了提取工艺条件。黄志芳等9为进一步提高浸取率，将牛膝水煮液经水浴，加入酸、碱处理等，使多糖浸提率达到7.2%。水煮提取法生产经济安全，设备简单易得，操作简便安全，但是多糖有可能在水煮条件下发生水解，而且水的极性大，选择性差，容易把诸多水溶性的无效成分浸提出来，给下一步提纯带来了困难。1.2 微波提取法微波具有极强透射性，在提取过程中，微波会穿透植物组织细胞，使细胞内温度、压力剧增而破裂，有效组分分散到外界溶剂中。郭婕等10通过实验研究多种因素对怀牛膝多糖得率的影响，得出最适宜的提取条件。郭宁等11采用该方法和传统水提法对怀牛膝多糖进行提取，结果表明，该法得到的多糖提取率更高。陈艾萌等12利用 Box-Behnken响应面法进一步优化了提取工艺，使ABP的收率得到显著的提高。微波提取法提取率高，操作过程简单环保，耗能少，是一项极具发展前景的提取工艺，被誉为“绿色分析化学”技术13，但是该法对设备要求苛刻，并且微波会对操作人员的安全造成严重的危害，所以目前暂不能推广使用。收稿日期：2022-08-25基金项目：河南省大学生创新创业计划重点资助项目（202110460067）作者简介：吴文荣（1974-），女，硕士，实验师，从事植物中有机物质浸提方面的研究工作，；通讯联系人：唐庆杰（1969-），男，博士，教授，从事光催化材料研究工作，。怀牛膝多糖的提取及应用吴文荣，岳佳馨，孙欣悦，李 静，史 昊，唐庆杰（河南理工大学 化学化工学院，河南 郑州 450001）摘要：怀牛膝多糖是从怀牛膝中提取、分离、纯化得到的一种小分子水溶性多糖化合物，具有抗肿瘤、增强免疫功能、抗凝血、抗病毒、改善骨质疏松、促进骨骼发育、抗氧化、抗衰老等效用，已成为重要的多糖药物之一，在临床应用和保健品中具有很大的开发潜力。对怀牛膝多糖的提取工艺及应用现状进行了系统深入的研究，并对其未来的进一步研究提出了可行性建议。关键词：怀牛膝；多糖；提取工艺；应用现状doi：10.3969/j.issn.1008-553X.2023.02.005中图分类号：R284文献标识码：A文章编号：1008-553X（2023）02-0019-05安 徽 化 工ANHUI CHEMICAL INDUSTRYVol.49，No.2Apr.2023第49卷，第2期2023 年 4 月19总第 242 期 2023 年第 2 期（第 49 卷）安 徽 化 工1.3 超声波辅助水提法超声波具有超强的冲击性，当植物组织细胞接触到超声波产生的高能量时，会因空化作用使细胞膜承载过负荷的压力，从而细胞破裂，有效组分流出。魏涛等14采用该工艺提取怀牛膝多糖，在最佳提取条件下，多糖提取率较传统水提工艺得到显著提高。姜艳等15得出ABP最佳工艺条件：超声波作用时间为50min，提取温度为50，醇沉浓度为90%，料液比为150，多糖得率达到11.7%。超声波辅助水提法提取得到的目标溶液中的杂质少，易于分离提纯其中的有效组分。这种方法简单易行，效率高，应用广泛。需要注意的是，超声波的有效作用区域一般为圆环形，超声波会因区域时间而衰减。为了避免超声空白区的形成，建议器皿的直径要适当，不要过大。此外，难以保证超声波器件的作用长时间维持在期望的水平，也无法实现在连轴运作时进行维修。1.4 三种提取工艺的比较酶解-超声波辅助微波多糖提取工艺酶解预处理超声波、微波处理图1怀牛膝多糖提取工艺流程表13种提取工艺的比较提取方法水煮提取法微波提取法超声波辅助水提法原理水对植物组织的穿透力强，用水作溶剂提取多糖微波射线辐射使植物细胞壁破裂、内容物流出超声波的“空化作用”破坏细胞膜使内容物流出，同时超声波有助于溶质的扩散优点提取工艺较为简单，设备简单，易于实现提取率较高，方法较为成熟以水提法为基础加以超声波辅助，提高提取率，同时时间短，耗能低缺点会消耗大量怀牛膝样品，提取率较低设备要求高，微波泄漏会给操作人员带来危害超声波的机械剪切作用会使多糖结构破坏、杂质溶出，降低多糖提取率表1是三种怀牛膝多糖提取工艺的对比。水煮提取法操作起来简单可行，缺点是效率低下，提取率低，难以达到要求的标准。微波法作为一种高效、选择性较强的提取方法，应用前景广阔，但是当微波功率过高时，可能会破坏有效组分的结构，而超声波对有效成分无破坏能力，因此可采用超声波辅助微波的提取方法，不仅可以显著提高提取效率，而且能够保护多糖的结构不受到破坏。另外，近些年来，提取植物有效组分时会广泛地采用酶技术。邓君16采用热水浸提法提取怀牛膝多糖，通过使用酶技术对怀牛膝进行预处理，结果ABP的浸提率得到了很大的提高。图1为怀牛膝多糖提取工艺流程。2 怀牛膝多糖的纯化工艺分析经萃取后得到的怀牛膝粗多糖中存在一定量的低聚糖、蛋白质、细胞色素以及其他小分子无效组分，杂质的存在不利于深入研究怀牛膝多糖均一部分的化学构成及生物学活性，因而，需要通过对粗牛膝多糖进行更深一步的纯化，以获得特性单一、分子量分布更为平衡的均一糖。纯化的过程主要是通过一系列工艺流程脱盐、脱色、除蛋白和一些小分子无效组分。而除蛋白在纯化过程中最为关键，不仅蛋白质本身会严重影响多糖的分级分离，而且它们还会吸附其他的无效组分，使除杂工作更困难，此外，蛋白质的存在还会增加怀牛膝多糖吸收空气中水分的能力，不利于多糖的贮存。分离纯化工艺流程如图2所示。粗多糖脱蛋白脱盐多糖柱层析透析图2怀牛膝多糖的分离纯化工艺流程2.1 脱蛋白纯化工艺在除去蛋白质的工艺中，比较传统的有三氯乙酸（TCA）法、鞣酸法和Sevage法三种方法。侯剑萍等对三种工艺进行研究对比，实验结果表明，三者对蛋白质的脱除率都较高。Sevage法在去除蛋白质时会使有效组分多糖的含量减少，导致原料浪费；鞣酸法可以有效避免多糖含量的降低，但对于多糖中表观色素的去除效果较差；三氯乙酸法（TCA）不仅能够显著去除蛋白，而且损耗的多糖比较少，还能够有效去除多糖中的表观色素，效果最为显著。冻融和等电点沉淀工艺也是去除蛋白质比较常见的工艺，这两种工艺的优点是操作条件比较简单。然而，怀牛膝的多糖溶液里通常会残留有少量低浓度的蛋白质，蛋白质脱除不彻底，若与其他工艺进行有机组合，取得的效果会更显著。20除此之外，常用的脱蛋白法还有酶解法。王金鹏等17采用Sevage法、三氯乙酸-Sevage法、壳聚糖絮凝法和胰蛋白酶法对刺五加多糖进行脱蛋白，对比实验结果发现，Sevage法造成多糖损失量偏大；三氯乙酸-Sevage法对蛋白质的去除率低下，不能达到预期的除蛋白效果；壳聚糖絮凝法除蛋白效果差，多糖损耗严重；酶解法操作简单，多糖的损耗小，蛋白质的去除率高，表明胰蛋白酶具有良好的脱蛋白效果，但酶受特异性的限制。龚力民等18将Sevage法、蛋白酶法和蛋白酶-Sevage联合法这三种脱蛋白工艺进行对比实验，由实验数据可得，脱蛋白效率相对较高的是 Sevage 法和联合法，而Sevage法会造成蛋白的损失量过大，从而导致原料的损耗。蛋白酶法作用时要求的条件较为温和，操作简单，对多糖的活性影响甚微，但酶具有特异性，适用范围受到很大的限制。多种因素综合考虑得出，除蛋白效果最显著的是蛋白酶-Sevage联合法。2.2 脱盐纯化工艺在脱盐时，透析法和分子筛法应用最为广泛。邓君对该两种方法进行了比较，研究发现，透析过程多糖的损失率为17.89%，而用葡聚糖凝胶脱盐，脱盐比较彻底而且多糖损失不高，仅为5.18%。侯剑萍等测得，透析法多糖损失率为（17.892.53）%，脱盐效率为（1083.78）%；分子筛法多糖损失率为（5.180.89）%，脱盐效率为（1289.23）%。实验数据表明，分子筛法相比于透析法，具有更高的脱盐效率。2.3 除小分子杂质杂质的存在会影响怀牛膝多糖的生物学活性，因此需要去除。透析法是传统的去除工艺，具有操作简单、工艺成熟等优点，但是去除周期比较长，通常要好几天。纤维过滤透析技术是一项新兴的生物纯化工艺，使用各种孔径的膜来对分子进行分级，该方法条件温和且生产周期较短。此法的关键在于透析膜的选用，适当的透析膜可以防止多糖成分的流失。2.4 柱层析纯化工艺除杂后，怀牛膝多糖的纯度基本达到了100%，但改变不了其仍是混合物的事实，其所含的成分在各方面上是不统一的，例如在分子量、组成、结构等方面的差异。怀牛膝多糖的纯化是研究怀牛膝多糖的药理以及确定影响因素的前提。多糖的分离工艺有纸层析、柱层析、高效液相层析、分子筛和各种电泳等。邓君先用Sephadex G-100 柱分离怀牛膝多糖，再用 DEAE-Sepharosefast-flow柱，然后比较两种方式对怀牛膝多糖的分离效果，得出最终分离工艺为先用Sephadex G-100柱分离怀牛膝粗多糖，然后用SephadexG-50对浓缩液进行脱盐，浓缩后冷冻干燥，得精制多糖。3 怀牛膝多糖的应用现状3.1 怀牛膝多糖的主要组成及性质怀牛膝多糖中蕴藏的组分种类极其丰富，其中占百分比含量最多的主要有葡萄糖、甘露糖和果糖这三种单糖。我们利用元素分析仪对其进行元素分析发现，其中不含有N、S、P等元素，说明没有氮、硫、磷成分存在。对单糖组分进行分析可以知道，怀牛膝多糖组分是均一的，其中果糖、葡萄糖比例大概为8 1，由与生物体健康代谢关系紧密的聚合度不同的六碳糖组成，其分子量为1400D，目前其大部分化学结构已经被鉴定出来了，含421糖，糖链中还含有果糖残基等。此外，实验中，我们可以从牛膝根中分离得到多种组分，如水溶性多糖、肽多糖和单糖等。怀牛膝多糖易溶于水，并且其存在于水中的形式主要为吡喃，微溶于乙醇和甘油，有较大的粘性，稳定性差，受热易降解，并且基本没有给电子能力，环状单糖或糖苷的比旋光度不会发生改变，但是能够诱发一些特殊的生物化学反应，口感微甜。3.2 怀牛膝多糖性质对其应用的影响利用怀牛膝多糖的溶解性对怀牛膝多糖选择合适的提取方法，高温处理会使糖链断开或者卷曲，加热时部分怀牛膝多糖会降解为单糖，不利于多糖的提取，所以实验中应注意对温度等的控制，保证实验条件适宜。因天然产物怀牛膝多糖各组分绿色无害，对生物体基本无副作用，作用效果稳定，作用范围辽广，十分安全，既可注射又可服用，且怀牛膝多糖味微甜，可与蜂蜜、饮品等结合起来，产生的效果更佳，目标人群更易接受，从而利于推广应用。3.3 怀牛膝多糖的应用侧重点国内外的研究团队已经着手对怀牛膝多糖的药理作用进行了较为透彻的研究，目前也研发出了多种相关的保健品、化妆品，但是提取率并不理想，且提取物中的杂质清除率也不是很高，因而怀牛膝多糖的提取是今后的研究重点。目前怀牛膝多糖的提取主要包括物理性粉碎、酶解、溶剂浸提、物理化学辅助提取、纯化等几个方面。3.4 研究改进提取怀牛膝多糖时所采用的工艺流程与提取大多数植物多糖的工艺方法趋于一致，主要分为清洗、烘干、吴文荣，等：怀牛膝多糖的提取及应用21总第 242 期 2023 年第 2 期（第 49 卷）安 徽 化 工粉碎、水提、浓缩、粗品等六大步骤，但是后期还要对获得的怀牛膝多糖进行分离提纯的工艺操作，主要是为了除去粗糖中含有的蛋白、小分子杂质、色素等非目标组分。为了使怀牛膝多糖的提取率更高，我们可以利用超声、微波、酶解等辅助水提。魏涛团队把超声波和水提法结合使用，研究各个单因素，如提取温度、超声波功率、提取时间、料液比等。在这个实验进行的基础上，采用正交实验法处理获得的数据并对其进行分析，从而得到用超声波辅助水提法可以获取的工艺提取的最佳条件。这种结合法使得工艺看起来繁琐复杂，但实际操作简单方便，且多糖的提取率相比于其他方法较高。郭捷团队主要研究了微波提取工艺，实验表明，微波功率过低，温度低，则浸提率不高；微波功率过大时，多糖所接受的能量较高，其结构易被破坏；加热温度较高，使部分多糖成分失活，这些均对提取多糖不利。当提取料液比过大，提取效果达不到预期；料液比过小，不仅提纯回收等操作效率低，而且容易造成浪费，人力物力成本也较大。经过对影响实验因素的优化调整，这种工艺方法可以帮助我们极大提高多糖的提取率。谷旭晗团队在提取川牛膝多糖时，主要采用纤维素酶，并且在提取过程中综合考查了材料川牛膝的体积大小、酶的用法用量、酶解及提取时间、反应温度、溶剂的pH及物料溶剂比等多方面的因素。此方法最大程度地提高多糖提取率，但提取时间过长，影响因素太多，操作复杂。以怀牛膝多糖为研究对象，将怀牛膝多糖的提取与纯化有机整合，探究得到提取纯化怀牛膝多糖的最优、最可行的新工艺。就目前掌握的资料，我们可以明确复杂性和多样性是植物多糖的特性，假设只采用单一的技术对植物中的多糖进行提取，很难高效获得所需的目标组分。为了达到实验预期目标，我们可以将各个技术的可取之处完美融合，争取探究出最优的提取条件，使得目标组分的提取率最大。4 结论目前国内外比较注重深入研究怀牛膝多糖的结构和效用，明确其各个基础的结构，然后探究并细化其对应的作用机理，以便于掌握怀牛膝多糖的效应机制。同时致力于优化其提取工艺，努力提高怀牛膝多糖的提取率，但是提取、分离、纯化的工艺都不够成熟。因此，需优化工艺，提高提取效率及纯度，方便我们在未来能够更合理有效地应用及使用怀牛膝多糖。怀牛膝多糖是一种水溶性的生物活性多糖，在保健和医药行业有很好的发展前景。如何更好地发挥其功效，应当从如下三个方面着手：一是使用联用技术或新技术使分离纯化得率更高；二是深层次探究如何在微分子领域找到怀牛膝多糖的结构和效用之间的联系，以便于进一步从分子水平上设计修饰其结构，从而提高其生物活性，或者发掘其新的生物活性；三是研究如何与其他活性物质组合运用，使其发挥出更大的作用。参 考 文 献1 王秋红，杨柳，姜海，等.怀牛膝中甾酮类成分的分离与鉴定J.中医药学报，2012，40（1）:69-71.2 任重伦.怀牛膝研究概况J.基层中药杂志，1996（4）:46-48.3 李娟，毕志明，肖雅洁，等.怀牛膝的三萜皂苷成分研究J.中国药学杂志，2007（3）:178-180.4 Li J T，Peng L，Hu Z H，et al.Structural development of root andtheir relationship to accumulation of triterpenoid saponins inAchyranthes bidentata BL J.2007，40（2）:121-129.5 宋义平，刘彩玉，周刚，等.牛膝多糖对小鼠细胞免疫功能的影响J.中药新药与临床药理，1998，9（3）:158-159.6 李金亭，胡正海.牛膝类药材的生物学与化学成分的研究进展J.中草药，2006，37（6）:952-956.7 王媛媛，张梦凡，查丽丽，等.川牛膝和怀牛膝多糖提取工艺研究J.长春师范大学学报，2016，35（10）:77-81.8 侯剑萍，王春霞.牛膝多糖的提取纯化工艺研究J.中国药房，2008，19（36）:2822-2824.9 黄志芳，黄志红，胡吉林，等.土牛膝中齐墩果酸、牛膝多糖的提取与鉴定J.中国实用药学，2010，65（17）:6-7.10 郭婕，李季平，刘中华.怀牛膝多糖的微波提取工艺研究J.中国果菜，2017，37（4）:16-19.11 郭宁，郭婕.怀牛膝茎叶多糖提取及生物活性J.周口师范学院学报，2017，34（2）:120-122.12 陈艾萌，潘洁，胡博，等.川牛膝多糖抗氧化活性测定和微波提取工艺优化J.中成药，2017，39（1）:80-84.13 刘玉峰，马海燕，李鲁盼，等.天然活性多糖提取工艺及结构解析研究进展J.辽宁大学学报，2018，45（2）:154-161.14 魏涛，何培新，封盛雪，等.怀牛膝多糖的超声波辅助提取工艺及其抗氧化性活性J.食品与发酵工业，2011，37（2）:191-194.15 姜艳，许海丹.超声波辅助提取牛膝多糖的工艺研究J.广州化工，2015，43（13）:109-110，147.16 邓君.牛膝多糖的提取纯化工艺及抗衰老活性成分研究D.重庆：西南师范大学，2001.17 王金鹏，陈寒青，邓力，等.刺五加多糖提取过程中不同脱蛋白方法的比较研究J.天然产物研究与开发，2009，21（1）:155-158.18 龚力民，刘伟，张楚晗，等.五倍子多糖脱蛋白方法的研究J.湖南中医药大学学报，2013，33（3）:44-46.（下转第26页）22总第 242 期 2023 年第 2 期（第 49 卷）安 徽 化 工ic liquids as green functional excipients to enhance drug solubilityJ.Pharmaceutics,2018,10(4)：288.16 Zhang,Y.,Cao,Y.,Meng,X.,Li,C.,Wang,H.,Zhang,S.Enhancement of transdermal delivery of artemisinin using microemulsion vehicle based on ionic liquid and lidocaine ibuprofenJ.Colloids and Surfaces B:Biointerfaces,2020,189：110886.17 Jesus,A.R.,Soromenho,M.R.,Raposo,L.R.,Esperana,J.M.,Baptista,P.V.,Fernandes,A.R.,Reis,P.M.Enhancement of water solubility of poorly water-soluble drugs by new biocompatibleN-acetyl amino acid N-alkyl cholinium-based ionic liquidsJ.European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics,2019,137：227-232.18 Herrera-Herrera,A.V.,Hernndez-Borges,J.,Rodrguez-Delgado,M.Ionic liquids as mobile phase additives for the high-performance liquid chromatographic analysis of fluoroquinoloneantibiotics in water samplesJ.Analytical and BioanalyticalChemistry,2008,392(7)：1439-1446.19 Chen,Z.,Chen,Y.Aqueous room temperature ionic liquids asgreen mobile phases for liquid chromatographic analysis of nicotine and cotinine in serumJ.Analytical Letters,2010,43(3)：393-405.20 NageswaraRao,R.,Ramachandra,B.,MastanVali,R.Reversed-phase liquid chromatographic separation of antiretroviral drugs ona monolithic column using ionic liquids as mobile phase additivesJ.Journal of Separation Science,2011,34(5)：500-507.Application of Ionic Liquids in Pharmaceutical ResearchTANG Zhong-liang,LI Xiao,ZHANG Zi-yi,LI Zi-yi,LI Yu-xiu,FENG Jing,LI Bing-dong（College of Pharmacy and Chemistry&Chemical Engineering,Taizhou University,Taizhou 225300,China）Abstract：Due to the special properties and structural controllability of ionic liquids,they can promote the chemical reaction process,improve the yield of products,reduce environmental pollution,and solve the problems of poor drug solubility,unstable product crystal form,poor biological activity and low drug delivery efficiency.Therefore,they have attracted extensive attention in the field of pharmaceutical research.This paper reviews the applications of ionic liquids inthe fields of drug synthesis,drug solubilization and chromatographic analysis.Key words：ionic liquid；drug synthesis；drug solubilization；chromatographic analysisExtraction and Application of Polysaccharides from Achyranthes BidentataWU Wen-rong，YUE Jia-xin，SUN Xin-yue，LI Jing，SHI Hao，TANG Qing-jie（College of Chemistry and Chemical Engineering，Henan Polytechnic University，Zhengzhou 450001，China）Abstract：Bidentata bidentata polysaccharide is a kind of small molecule water-soluble polysaccharide compound，which has the effects of anti-tumor，enhancing immune function，anticoagulation，antiviral，improving osteoporosis，promoting bone development，anti-oxidation，anti-aging and so on.It has become one of the important polysaccharidedrugs，and has great development potential in clinical application and health products.In this paper，the extraction process and application status of Achyranthes bidentata polysaccharide were systematically studied，and the feasibility suggestions for further study were put forward.Key words：Achyranthes bidentata;polysaccharides;extraction process;application status（上接第22页）26