多肽合成与生物活性肽幻灯片.ppt

多肽合成与生物活性肽多肽合成与生物活性肽1 一、多肽与多肽合成一、多肽与多肽合成2氨基酸氨基酸甘氨酸（甘氨酸（Gly、G）、丙氨酸（）、丙氨酸（Ala、A）、苯丙氨酸）、苯丙氨酸（Phe、F）、谷氨酰胺（）、谷氨酰胺（Gln、Q）、天冬酰胺（）、天冬酰胺（Asn、N）、缬氨酸（）、缬氨酸（Val、V）、亮氨酸（）、亮氨酸（Leu、L）、异亮氨酸）、异亮氨酸（Ile、I）、脯氨酸（）、脯氨酸（Pro、P）、甲硫氨酸（）、甲硫氨酸（Met、M）、）、半胱氨酸（半胱氨酸（Cys、C，巯基巯基）、丝氨酸（）、丝氨酸（Ser、S，羟基羟基）、）、苏氨酸（苏氨酸（Thr、T，羟基羟基）酪氨酸（）酪氨酸（Tyr、Y，酚羟基酚羟基）、色氨酸（色氨酸（Trp、W，吲哚基吲哚基）、谷氨酸（）、谷氨酸（Glu、E，羧基羧基）、）、天冬氨酸（天冬氨酸（Asp、D、羧基羧基）、赖氨酸（）、赖氨酸（Lys、K，氨基氨基）、）、精氨酸（精氨酸（Arg、R，氨基氨基）、组氨酸（）、组氨酸（His、H，胺基胺基）3多肽（蛋白质）多肽（蛋白质）氨基酸氨基酸“首尾首尾”以酰胺键相连，相连的氨基酸数较以酰胺键相连，相连的氨基酸数较少时称多肽，较多时称蛋白质。少时称多肽，较多时称蛋白质。多肽、蛋白质多肽、蛋白质4人工合成胰岛素人工合成胰岛素 19651965年，我国上海生化所、上海有机所和北京大年，我国上海生化所、上海有机所和北京大学的科学家经过学的科学家经过6 6年多的努力，在世界上首次人工合成年多的努力，在世界上首次人工合成具有生命活力的蛋白质牛胰岛素。具有生命活力的蛋白质牛胰岛素。（1953年合成八肽催产素，获得了年合成八肽催产素，获得了1955年诺贝年诺贝尔化学奖。）尔化学奖。）胰岛素由胰岛素由A A、B B两个肽链组成，两个肽链组成，A A链有链有2121个氨基酸，个氨基酸，B B链有个链有个3030个氨基酸，个氨基酸，A A链和链和B B链间由三个二硫键连接链间由三个二硫键连接起来。起来。5 上面的氨基酸缩合脱水形成肽的反应式在上面的氨基酸缩合脱水形成肽的反应式在生物体内的多肽、蛋白质的合成是成立的，但生物体内的多肽、蛋白质的合成是成立的，但在人工合成多肽时，这一反应式是不能实现的。在人工合成多肽时，这一反应式是不能实现的。6液相法合成多肽液相法合成多肽 7 固相多肽合成方法固相多肽合成方法 MerrifieldMerrifield在在19621962年开创了固相多肽合成法，并年开创了固相多肽合成法，并于于19841984年获得诺贝尔化学奖。年获得诺贝尔化学奖。固相多肽合成法的原理：用交联聚合物树脂作为固相多肽合成法的原理：用交联聚合物树脂作为载体，肽的合成在交联聚合物树脂内进行（共价固载载体，肽的合成在交联聚合物树脂内进行（共价固载于载体上）。交联聚合物树脂在任何溶剂中都不能溶于载体上）。交联聚合物树脂在任何溶剂中都不能溶解，但在某些溶剂中可溶胀，这样反应物、催化剂等解，但在某些溶剂中可溶胀，这样反应物、催化剂等可扩散到树脂内部参与反应。每一步反应结束后，通可扩散到树脂内部参与反应。每一步反应结束后，通过简单的过滤、洗涤，即可将剩余的反应物、催化剂、过简单的过滤、洗涤，即可将剩余的反应物、催化剂、副产物等去掉，然后进行下一步反应。最后将合成的副产物等去掉，然后进行下一步反应。最后将合成的肽从树脂上裂解下来。肽从树脂上裂解下来。8聚合聚合9功能基基化功能基基化1011固相合成固相合成12固相合成的优点固相合成的优点可以用过量的反应试剂使反应完全。可以用过量的反应试剂使反应完全。每每步步的的产产物物都都固固定定于于不不溶溶于于任任何何溶溶剂剂的的固固相相载载体体上上，因因此此所所需需产产物物与与其其它它过过量量试试剂剂、催催化化剂剂等等小小分分子子试试剂剂的的分分离可通过简单的过滤而实现。离可通过简单的过滤而实现。在在裂裂解解前前的的所所有有操操作作步步骤骤中中，固固相相载载体体始始终终处处于于同同一一容容器中，没有任何机械损失。器中，没有任何机械损失。可可以以用用大大过过量量的的反反应应试试剂剂及及催催化化剂剂，使使每每一一步步反反应应趋趋于于完全，提高产率，使最后的产物的纯化更加容易。完全，提高产率，使最后的产物的纯化更加容易。没没有有液液相相法法中中遇遇到到的的当当肽肽链链较较长长时时不不易易找找到到合合适适的的溶溶剂剂的问题。的问题。容容易易实实现现自自动动化化。现现已已有有自自动动化化程程度度很很高高的的自自动动多多肽肽合合成仪。成仪。13二、生物活性肽二、生物活性肽14 生物活性肽在生命活动中起着非常重要的作用，如生物活性肽在生命活动中起着非常重要的作用，如胰岛素、生长激素、促肾上腺皮质激素、催产素等。胰岛素、生长激素、促肾上腺皮质激素、催产素等。许多天然活性肽或天然活性肽的类似物也是非常重许多天然活性肽或天然活性肽的类似物也是非常重要的药物，多肽作为药物具有如下优点。要的药物，多肽作为药物具有如下优点。高效、专一，用量少高效、专一，用量少 如鲑鱼降钙素剂量为 20g/支（50000支/g)结构多变，随着各种生物技术和计算机模拟技术的发结构多变，随着各种生物技术和计算机模拟技术的发展，可得到具有各种功能的多肽药物展，可得到具有各种功能的多肽药物 如在计算机模拟的基础上，设计合成了治疗艾滋病的多肽药物T-20。FDA已批准200多种多肽和蛋白质药物的临床应用。代谢产物为无毒的氨基酸代谢产物为无毒的氨基酸15抗菌素的耐药性抗菌素的耐药性 抗菌素的使用挽救了无数的生命，使人的预期寿抗菌素的使用挽救了无数的生命，使人的预期寿命增加了十年以上。但随着抗菌素的使用，细菌也逐命增加了十年以上。但随着抗菌素的使用，细菌也逐渐对其产生了耐药性。一个新药研制的平均周期是约渐对其产生了耐药性。一个新药研制的平均周期是约10年，而一个新抗菌素临床使用后细菌对其产生耐药年，而一个新抗菌素临床使用后细菌对其产生耐药性的平均时间为约性的平均时间为约2年。年。一些超级细菌对目前使用的所有抗菌素包括被称一些超级细菌对目前使用的所有抗菌素包括被称为抗菌最后防线的万古霉素具有耐药性。细菌感染住为抗菌最后防线的万古霉素具有耐药性。细菌感染住院的患者中约院的患者中约7%由于耐药细菌感染而死亡。由于耐药细菌感染而死亡。阳离子抗菌肽阳离子抗菌肽16抗菌素的种类抗菌素的种类1.-内酰胺类2.大环内酯类3.喹诺酮4.四环素类5.氨基糖苷类6.磺胺类17耐药机理耐药机理1.1.细菌变异细胞壁上抗菌素的结合部位，使抗菌素细菌变异细胞壁上抗菌素的结合部位，使抗菌素 失去与细胞壁的结合能力。失去与细胞壁的结合能力。如万古霉素与细菌细胞壁粘肽末端的-D-Ala-D-Ala结合，从而抑制细菌的某些生理功能，起到抑菌作用。18 抗万古霉素的细菌则把抗万古霉素的细菌则把-D-Ala-D-Ala-D-Ala-D-Ala变异成变异成-D-Ala-D-Ala-D-LacD-Lac，使万古霉素对其失去结合力而不起作用，使万古霉素对其失去结合力而不起作用192.2.通过分泌通过分泌-内酰胺酶而破坏化学上很不稳定的内酰胺酶而破坏化学上很不稳定的-内酰胺类抗菌素的内酰胺类抗菌素的-内酰胺环。内酰胺环。3.3.分泌某种酶修饰抗菌素上的某些基团如乙酰化羟分泌某种酶修饰抗菌素上的某些基团如乙酰化羟基等。基等。20阳离子抗菌肽阳离子抗菌肽19811981年年BomanBoman等人从西哥罗佩蛾（等人从西哥罗佩蛾（Moth Moth Hyalophora Hyalophora cecropiacecropia）体中分离得到抗菌多肽天蚕素）体中分离得到抗菌多肽天蚕素（cecropincecropin）（）（NatureNature，19811981，292292，246246）。）。抗菌肽广泛存在于动植物体内，用来对付细菌、病抗菌肽广泛存在于动植物体内，用来对付细菌、病毒和真菌等，已发现的抗菌肽已超过毒和真菌等，已发现的抗菌肽已超过10001000种。种。抗菌肽中都含有较多的碱性氨基酸，在生理条件下抗菌肽中都含有较多的碱性氨基酸，在生理条件下带净正电荷，因此也叫阳离子抗菌肽。带净正电荷，因此也叫阳离子抗菌肽。21 抗菌肽的阳离子部分与细菌的细胞膜（阴离子性抗菌肽的阳离子部分与细菌的细胞膜（阴离子性磷脂膜）的磷酸基负离子结合（静电作用），多肽的磷脂膜）的磷酸基负离子结合（静电作用），多肽的疏水部分与细胞膜的碳氢链结合（疏水作用），从而疏水部分与细胞膜的碳氢链结合（疏水作用），从而起到抑菌作用。起到抑菌作用。抗菌机理抗菌机理22抗菌肽不易产生耐药性的原因抗菌肽不易产生耐药性的原因 由于阳离子多肽与细菌细胞膜的结合的特异性不由于阳离子多肽与细菌细胞膜的结合的特异性不高，细菌不易通过简单的变异或修饰多肽产生耐药性。高，细菌不易通过简单的变异或修饰多肽产生耐药性。抗菌肽的副作用抗菌肽的副作用 大部分抗菌肽除具有抗菌活性外，对哺乳动物细大部分抗菌肽除具有抗菌活性外，对哺乳动物细胞也有毒性，如溶血活性胞也有毒性，如溶血活性。抗菌肽的抗菌活性和溶血活性都由多肽的两亲性引起，但一些抗菌肽具有溶血活性，而另一些抗菌肽没有溶血活性的现象不能达到满意的解释。232425*BC,blood cell;H,haemolymph;E,epithelial tissue.M.Zasloff,Nature,2002,415,389-39526Table Commercial development of antimicrobial peptides of animal originMode of use Peptide Company Application StageTotical MSI-78 Genaeral Infected diabetic Completed Phase III;not foot ulcers approved by FDA,pend-ing additional studiesTotical MBI-226 Micrologix Catheter infection Phase IIITotical MBI-594 Micrologix Acne Phase IIOral IB-367 Introbiotics Mucostis Phase IIIOral P-113 Demegen Gingivitis Phase IISystemic Heliomycin Entomed Antifungal Preclinical Systemic Human AM Pharm Antibacterial Preclinical lavotoferricinSystemic BPI Xoma Meningococcal Phase III meningitisM.Zasloff,Nature,2002,415,389-39527目前的研究热点目前的研究热点抗菌机理、溶血机理抗菌机理、溶血机理提高抗菌活性，抗菌活性不够高，因而用量较大提高抗菌活性，抗菌活性不够高，因而用量较大减小链长，肽链较长时合成成本高，且免疫源性减小链长，肽链较长时合成成本高，且免疫源性高高较少溶血副作用较少溶血副作用28GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ-NH2 Melittin 的氨基酸序列蜂毒肽蜂毒肽(melittin)类似物类似物 我们的研究发现，蜂毒肽我们的研究发现，蜂毒肽1226残基片断基本残基片断基本保留抗菌活性，但溶血活性基本消失。保留抗菌活性，但溶血活性基本消失。蜂毒肽由蜂毒肽由26个氨基酸组成，具有很强的抗菌活性，个氨基酸组成，具有很强的抗菌活性，同时还具有很强的溶血副作用。同时还具有很强的溶血副作用。29Melittin的短缺肽及其类似物抗菌和溶血活性的短缺肽及其类似物抗菌和溶血活性 PeptideHD50 ag.HRBC（g/ml）MIC ag.SA（g/ml）Melittin56.25M(13-26)1000012.5M(12-26)1000012.5M(11-26)100006.25M(11-26,G12W192L)11006.25M(11-26,G12A15W193L)2903.130以以M(12-26)M(12-26)为模板，逐个改变为模板，逐个改变1-91-9位的疏水性位的疏水性GLPALISWIKRKRQQ-NH2结果：结果：1.1.右侧右侧氨基酸的疏水性增加，氨基酸的疏水性增加，则其抗菌活性则其抗菌活性显著的增加显著的增加；左侧左侧氨基酸的疏水性增加，氨基酸的疏水性增加，则其抗菌活性则其抗菌活性略有增加略有增加。2.2.右侧右侧氨基酸的疏水性增加，氨基酸的疏水性增加，则其溶血活性则其溶血活性减小减小；左侧左侧氨基酸的疏水性增加，则氨基酸的疏水性增加，则其溶血活性其溶血活性增加增加。31三、聚合物修饰多肽、蛋白质药物三、聚合物修饰多肽、蛋白质药物32多肽、蛋白质药物的缺点多肽、蛋白质药物的缺点口服生物利用率低口服生物利用率低 消化系统各种蛋白水解酶的降解作用保存寿命短保存寿命短血液半衰期短血液半衰期短 血液及各器官中蛋白水解酶的降解作用、肾过滤清楚作用具有免疫原性具有免疫原性不易穿透生物膜不易穿透生物膜33聚乙二醇，聚乙二醇，poly(ethylene glycol)(PEG)，poly(ethylene oxide)(PEO)：特性：特性：1.两亲性，既亲水又亲油，可溶于水和许多有机溶两亲性，既亲水又亲油，可溶于水和许多有机溶剂如卤代烃，链高度柔顺。剂如卤代烃，链高度柔顺。2.无毒，可静脉注射、口服和外用无毒，可静脉注射、口服和外用3.高生物相容性，是已知聚合物中对蛋白质的吸附高生物相容性，是已知聚合物中对蛋白质的吸附作用最小的聚合物。表面用作用最小的聚合物。表面用PEG修饰可减小对蛋修饰可减小对蛋白质吸附，进而降低被白质吸附，进而降低被RES的俘获和免疫反应。的俘获和免疫反应。34多肽、蛋白质药物用多肽、蛋白质药物用PEG修饰修饰Main advantages of PEGylated protein.35PEG conjugateType of PEGylationsYear to marketDiseasePEGasparaginase(Oncaspar)Random,linear PEG1994Acute lymphoblastic leukemiaPEGadenosine deaminase(Adagen)Random,linear PEG1990Severe combinedimmunodeficiency disease(SCID)PEGinterferon 2a(Pegasys)Random,branched PEG 40 kDa2002Hepatitis CPEGinterferon 2b(PEGIntron)Random,linear PEG 12 kDa2000Hepatitis C and clinical trials for cancer,multiple sclerosis,HIV/AIDSApproved PEG conjugates36PEG conjugateType of PEGylationsYear to marketDiseasePEGG-CSF(pegfilgrastim,Neulasta)Selective,linear PEG 20 kDa2002Treating of neutropenia during chemotherapyPEGgrowth hormone receptor antagonist(Pegvisomant,Somavert)Random,linear PEG 5 kDa(genetic modified protein)2002AcromegalyApproved PEG conjugates(continued)37PEG修饰多肽、蛋白质药物的作用修饰多肽、蛋白质药物的作用1.柔顺的柔顺的PEG链及其结合的水分子对多肽、蛋白质链及其结合的水分子对多肽、蛋白质起到保护作用，减小蛋白酶对其的降解作用。起到保护作用，减小蛋白酶对其的降解作用。2.PEG修饰使其分子量增大，减小肾过滤的清除作修饰使其分子量增大，减小肾过滤的清除作用。用。3.PEG的保护作用减小其免疫原性。的保护作用减小其免疫原性。4.PEG化后在更宽的化后在更宽的pH和温度范围内更稳定。和温度范围内更稳定。使多肽、蛋白质药物使多肽、蛋白质药物1.具有更高的疗效具有更高的疗效2.显著延长其血液半衰期显著延长其血液半衰期3.副作用小副作用小4.保存时间长保存时间长38PEG分子量、支化对修饰多肽、蛋白质药物的影响分子量、支化对修饰多肽、蛋白质药物的影响PEG分子量愈大，则对多肽、蛋白质的保护作用分子量愈大，则对多肽、蛋白质的保护作用愈大，血液半衰期愈长，免疫原性愈小。愈大，血液半衰期愈长，免疫原性愈小。支化的支化的PEG对多肽、蛋白质的保护作用比直链对多肽、蛋白质的保护作用比直链PEG的大。的大。PEG化往往使多肽、蛋白质的体外生物活性降低。化往往使多肽、蛋白质的体外生物活性降低。PEG分子量愈大，体外生物活性降低降低得愈多。分子量愈大，体外生物活性降低降低得愈多。PEGPEG分子量的大小对多肽、蛋白质的保护作用分子量的大小对多肽、蛋白质的保护作用的影响和对其体外生物活性的影响是相互矛盾的。的影响和对其体外生物活性的影响是相互矛盾的。39Interferon -2a的的PEG化化Reaction mechanism of the synthesis of PEG2-IFN.P.Bailon,et al.,Bioconjugate Chem.,2001,12,195-202 40In Vitro Antiviral Activities of Interferon-2a and PEG2-IFNInterferon-2a PEG化后其血清半衰期增加了化后其血清半衰期增加了70倍。倍。41In vivo antitumor activity of interferon-2a(top panel)and PEG2-IFN(bottom panel)42Growth hormone-releasing factor(GRF)的的PEG化化如果多肽中含有多个氨基，如果多肽中含有多个氨基，PEG化往往得到混合物。化往往得到混合物。P.Espositoa,et al.,Adv.Drug Delivery Rev.2003,55,12791291Primary amino acid sequence of GRF43In vitro biological activity of the two isomers composition GRF1PEG5000 and of the two single mono-PEGylated isomers44Biological stability in human pooled plasma4546抗菌肽的抗菌肽的PEG化化Nisin用用5000kDa的的PEG修饰后抗菌活性完全丧失。修饰后抗菌活性完全丧失。A.Guiotto,et al.,Il Farmaco 2003,58,45-5047tachyplesin用用5000kDa的的PEG修饰修饰Y.Imura,et al.,Biochim.Biophys.Acta 2007,1768,1160116948PEG分子量、支化对修饰多肽、蛋白质药物的影响分子量、支化对修饰多肽、蛋白质药物的影响PEG分子量愈大，则对多肽、蛋白质的保护作用分子量愈大，则对多肽、蛋白质的保护作用愈大，血液半衰期愈长，免疫原性愈小。愈大，血液半衰期愈长，免疫原性愈小。支化的支化的PEG对多肽、蛋白质的保护作用比直链对多肽、蛋白质的保护作用比直链PEG的大。的大。PEG化往往使多肽、蛋白质的体外生物活性降低。化往往使多肽、蛋白质的体外生物活性降低。PEG分子量愈大，体外生物活性降低降低得愈多。分子量愈大，体外生物活性降低降低得愈多。PEGPEG分子量的大小对多肽、蛋白质的保护作用分子量的大小对多肽、蛋白质的保护作用的影响和对其体外生物活性的影响是相互矛盾的。的影响和对其体外生物活性的影响是相互矛盾的。49PEG修饰降低生物活性的原因修饰降低生物活性的原因1.直接修饰在活性部位。直接修饰在活性部位。2.PEG的位阻作用。的位阻作用。3.从热力学原理分析，多肽的从热力学原理分析，多肽的PEG化后其平动和转化后其平动和转动熵的增加是使其活性降低的普适原因动熵的增加是使其活性降低的普适原因。50用大分子量PEG修饰多肽（文献中采用）（粗线代表多肽，细线代表PEG）用小分子量PEG修饰强疏水性多肽的聚集和与受体的作用51Self-assembly of PEGylated peptides and shielding effect by PEG shell 52多肽的固相合成及其PEG化MA GLLALILWIKRKR-NH2 mPEG750-MA mPEG750-GLLALILWIKRKR-NH2mPEG1100-MA mPEG1100-GLLALILWIKRKR-NH253TEM images of mPEG750-MA(a)and mPEG1100-MA(b)aggregates 54Degradation profiles of MA,mPEG750-MA and mPEG1100-MA incubated with chymotrypsin(3.64 g/mL)at pH 4.5 and 37C 55Degradation profiles of MA,mPEG750-MA and mPEG1100-MA incubated with 20%bovine calf serum at 37C 56Antimicrobial activities of MA,mPEG750-MA and mPEG1100-MA 57药物的靶向释放药物的靶向释放58药物的控制释放药物的控制释放缓释缓释 在一定的时间内以较恒定的释放速率释放，药物的缓释不仅减少了给药次数，减小药物用量，提高疗效，还大大减小药物副作用。靶向释放靶向释放 使药物主要释放在病灶部位，而正常组织中的药物浓度很小，这样可使用很小的剂量而病灶部位仍可达到较高的药物浓度，这可大大降低某些毒性较大的药物如许多抗癌药对正常组织的毒性。低水溶性药物的释放低水溶性药物的释放 一些药物的水溶性很小，很难直接给药，将药物负载于纳米载体内，通过纳米载体将其运送到目标组织释放。59靶向释放的方法靶向释放的方法1.被动靶向：被动靶向：癌、炎症和血管梗塞等病变组织具有多孔性的血管系统，纳米粒子易渗透到这些组织中，而其弱淋巴引流作用又使进入的纳米粒子不易再扩散出去，即EPR 作用。2.配体靶向：配体靶向：将识别目标细胞的配体偶联于载体表面，使其识别目标细胞。如将对癌细胞有特异识别作用的叶酸、多肽、抗体等配体偶联于载体的表面，从而识别癌细胞。3.生理微环境感应靶向：生理微环境感应靶向：病变组织的微环境的不同，如癌组织细胞外的pH 值为67，细胞内的内含体和溶酶体内的pH 值分别为56 和45。载药的纳米载体在血液中不释放，当其到达癌组织或通过细胞内吞作用进入癌细胞内时，由于环境pH 值的降低而释放所载的药物。4.物理作用激发靶向：物理作用激发靶向：通过外部的物理作用如磁、光等的感应靶向。60EPR 作用作用61嵌段聚合形成胶束和负载药物示意图嵌段聚合形成胶束和负载药物示意图62pH敏感共价键负载阿霉素胶束敏感共价键负载阿霉素胶束63通过透析法（通过透析法（a）和水包油微乳液法（）和水包油微乳液法（b）负载药物）负载药物64pH敏感敏感polyHis-b-PEG胶束胶束65多功能纳米药物释放体系：多功能纳米药物释放体系：将多种靶向策略集中将多种靶向策略集中于同一体系中，甚至将多重靶向的药物释放和成于同一体系中，甚至将多重靶向的药物释放和成像探针也结合起来，使药物和探针都靶向到达病像探针也结合起来，使药物和探针都靶向到达病灶部位，提高疗效并提高成像诊断的灵敏度。灶部位，提高疗效并提高成像诊断的灵敏度。66负载阿霉素和负载阿霉素和Fe3O4纳米粒子的多功能纳米粒子的多功能PEG-b-PLGA胶束胶束67负载阿霉素的负载阿霉素的MPEG-b-PMAA-b-PGMA包覆包覆Fe3O4纳米粒子纳米粒子MPEG-b-PMAA-b-PGMA68