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宏基因组学研究进展及其应用
摘要：
本文先简要介绍了当前生物化学的一些研究热点，再针对宏基因组学展开论述，介绍了宏基因组学的产生背景和概念，当前的研究进展及应用。
宏基因组学尝试通过免培方法获得微生物的纯培养，主要技术包括 DNA的提取、文库的构建和目标基因克隆的筛选，可用于开发新型酶、发现新基因、筛选医药等方面。
关键字：宏基因组学；宏基因组学基本策略；文库构建与筛选；宏基因组学研究进展及其应用
引言：　
微生物是地球上种类最多、数量最大、分布最广的生物群。仅原核生物(细菌和古细菌)即构成地球生物总量的的25～50 %[1]。自然条件下，包括病毒在内的微生物 ,通过群落广泛参与 C、N、O 和 S等重要元素的循环转化，在人体的食物消化、毒素降解及机体免疫反应，环境污染物降解等方面发挥着重要作用[2]。人们对于微生物的研究主要是建立在纯培养基础上，后来人们发现通过纯培养方法估计的环境微生物多样性只占总量的 0.1%~1%[3]，多达 99%以上的微生物是不可培养的, 其中蕴含着巨大的应用潜能——其代谢产物中可能有众多具有应用开发价值的化合物[4]。为了研究不能培养的微生物，一个全新的理念——宏基因组学应运而生，该技术不需预先培养就能开发这些微生物基因组，目前已广泛应用于微生物活性物质的开发与利用、环境微生物种群分布及动态变化分析等方面的研究[5]。
宏基因组学的提出为解决上述问题提供了一个可行途径。宏基因组学以生境中全部DNA作为研究对象，通过克隆、异源表达来筛选有用基因及其产物。由于突破了传统研究领域无法涵盖不可培养微生物的瓶颈，宏基因组学概念及研究方法一经提出，就被广泛接受。尽管在方法上还存在一定缺陷，但并不妨碍不同领域学者利用该方法来研究各种生境中微生物生态以及筛选功能基因的热情，有关宏基因组学研究的文章逐年增多[4]。
1. 宏基因组学的概念
宏基因组( metagenome) 的概念是指从生境样本中取得全部微生物的基因组, 而不是采用传统的培养微生物的基因组。宏基因组的样本既包括可培养的微生物，也包括更大量的传统方法无法研究的不可培养微生物[6]。而所谓宏基因组学
(也称元基因组学Metagenomics 、微生物环境基因组学 Microbial Environmental Genomics、生态基因组学 Ecogenomics ) 就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和测序分析为研究手段，以微生物多样性、 种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法，一般包括克隆、构建文库和功能分析筛选等工作[7]。
2. 宏基因组学的基本策略及方法
2.1宏基因组学的基本策略
宏基因组学的研究还处于初期发展阶段，但其研究的基本过程和基本策略已基本清楚。在此要强调的是，宏基因组学研究有着明确的指导思想，它是在反向生物学原则指导下，基于特定生态环境基础上，依据整体、系统、动态变化和相互作用的观点，运用特殊的技术路线和方法，对研究范围中所有基因组展开研究的学科。

宏基因组学是一种整体性的研究策略，它建立在微生物基因组学的迅速发展和聚合酶链式反应广泛应用的基础之上，是一种不依赖于人工培养的微生物基因组分析技术，涵盖了生物信息统计分析和基因组两方面的意义和技术，其策略是从特定环境中直接分离所有微生物DNA，将大片段的DNA 克隆到受体菌中表达，然后根据某些生物活性筛选有应用价值的克隆。[8]
2.2宏基因组学研究的基本方法
宏基因组学以基因组技术为基础，基本程序包括：环境样品中宏基因组的提取，将DNA克隆到载体中;载体转化宿主细菌建立环境基因组文库，环境基因组文库分析和筛选。近年来，随着新一代高通量、低成本测序仪的问世，宏基因组的研究可对特定生境中的基因组片段直接进行测序而不用构建文库，从而避免了在文库构建过程中利用细菌对样品进行克隆以及克隆中引起的偏差，简化了宏基因组研究的基本操作，提高了测序效率，极大地促进了宏基因组学发展[9]。
2.2.1宏基因组 DNA 的提取
环境样品 DNA的提取是文库构建中最重要、最关键的一步，不仅要尽可能地将环境中所有微生物的 DNA提取出来，还要保证一定的 DNA片段长度和完整性。另外，环境样品中都含有一定的杂质 (如土壤中的腐殖酸类物质)，这些物质可抑制分子克隆中多种酶的活性，因此必须将其除去[10]。
目的样品的采集须严格遵循取样规则，使样品能最好地代表自然状态下的微生物状态[9]。根据提取宏基因组前是否分离细胞，提取方法可分为原位裂解法和异位裂解法。
原位裂解法主要是通过去污剂处理(如 SDS)，酶解法(如蛋白酶 K)等直接破碎样品中的微生物而使DNA 得以释放。由于无须对样品微生物进行复性，且黏附于颗粒上的微生物细胞亦能被裂解，原位裂解所得 DNA 能更好地代表样品微生物的多样性，且操作简单，成本低，DNA 提取率高。但该法提取的 DNA 片段较小(1～50 kb) ，通常适用于构建小片段文库的 DNA 提取[11]。
异位裂解法先用物理方法将微生物从样品中分离出来，然后采用较温和的方法抽提 DNA，可获得纯度较高的大片段 DNA(20～500kb) ，但该法操作繁琐，一些微生物基因组在分离过程中可能丢失，温和条件下一些细胞壁较厚的微生物 DNA抽提不出来，提取率较低且成本高，通常适用于构建大片段插入文库的 DNA 提取[12 ]。
2.2.2宏基因组文库构建与筛选
宏基因组文库的构建沿用了分子克隆的基本原理和技术方法，并根据具体环境样品的特点和建库目的采取了一些特殊的步骤和策略。
构建宏基因组文库的技术主要包括：提取和纯化环境微生物DNA、选取合适的克隆载体以及选择宿主菌株。基本原则是以分离独立基因或者一些编码新代谢功能的小操纵子为目的时，以小插入片段载体( 如质粒) 构建文库，提取和纯化DNA 时只需考虑纯度和物种的丰度[13]；而大插入片段文库(如Cosmid、Fosmid 或者 BAC)适合于获取编码复杂生物合成途径的大基因片段或者基因簇，但是构建这种文库需要提取和纯化更高长度和纯度质量要求的DNA。
2.2.2.1载体选择
DNA 提取后就可以构建文库。在文库构建过程中，载体是文库构建所必需的因素,而且在活性物质筛选是也发挥极其重要的作用。载体选择的原则主要考虑是否有利于目标基因扩增、表达及在筛选细胞毒类物质时表达量的调控等。筛选目标物不同，其载体不同,筛选技术手段也有所不同。由于活性物质多是微生物的次生代谢物，其代谢途径由多基因调控。因此，有必要尽量插入大片段 DNA以获得完整的代谢途径多基因簇，以期达到预期目的。
2.2.2.2宿主选择
宿主在筛选目标物的过程中起到至关重要的作用。选择宿主主要考虑重组体在宿主细胞中的稳定性、转化效率、宏基因表达量、筛选的目标性状缺陷型 (如溶血或抗菌 )等因素。GUNNAR HAGELI NA 等 [14]指出，微生物种类不同，其所产生的活性物质类型明显不同。因此，应结合不同的研究目的和筛选不同的活性物质考虑选择与其相适应的宿主菌株。
2.2.2.3宏基因文库的筛选
目前对环境宏基因组文库筛选有 3种途径: 功能的筛选 ( function
driven screening)、序列的筛选( sequence driven screening)和底物诱导基因表达技术的筛 选 ( substrate induced gene expression screening ,SIGEX )。
由于宏基因组的高度复杂性, 需要通过高通量和高灵敏度的方法来筛选和鉴定文库中的有用基因。筛选技术大致可分为 3 类[ 15]，基于核酸序列差异分析的筛选、基于克隆子的特殊代谢活性(功能驱动)的筛选、基于底物诱导基因的表达的筛选，也叫 SIGEX 法( Substrate induced gene expression screening method)[16]。
2.2.3宏基因组文库的分析
根据不同的研究目的，宏基因组文库的分析可以从生物活性水平、化合物结构水平以及DNA 序列水平设计不同的筛选方案，可分为功能分析和序列分析。
2.2.3.1功能分析
根据重组克隆产生的新活性进行筛选 ,可用于检测编码新型酶的全部新基因或者获取新的生物活性物质。例如从文库中筛选能表达抗菌物质的克隆。功能分析法根据重组克隆产生的新活性进行筛选,可用于检测编码新型酶的全部新基因或者获取新的生物活性物质[8]。
2.2.3.2序列分析
有2 种主要方法: 一种是根据已知保守序列设计引物或探针，通过PCR 扩增或杂交来筛选目的克隆。另一种方法是对含有16S rRNA 等系统进化锚定基因的克隆进行测序。一个典型的宏基因组分析涉及多个轮次,以确保从生态环境标本中分离到目的基因,及尽可能多地分析DNA 序列所编码的信息。
2.2.3.3宏基因组序列分析技术的进步
近年发展起来的高通量基因组测序技术[17]，不需要克隆或 PCR便能获取大量的 DNA序列信息，相应地需要有新的方法来比较这些宏基因组数据，不断进步的序列分析技术以及众多生物信息学工具和数据库[18]的出现将为宏基因组数据的分析提供便利,如针对原核微生物宏基因组进行分析的软件J Coast[19]、 可对多组宏基因组数据进行交互分析和比较的宏基因组分析工具 MEGAN等[20]。由于宏基因组技术提取的是环境总 DNA，所以给基因的鉴定归属带来很大困难(这一过程被称为 binning) ，现今只有 5 kb以上的片段可进行有效的鉴定归类，DNA条形码技术已被用来尝试解决这一问题[21]此外,比较宏基因组技术、 基因芯片技术等均可用于分析宏基因组序列[22]。
3. 宏基因组学研究进展及其应用
近年来,宏基因组学研究已渗透到各个研究领域,包括海洋、土壤、热液口、热泉、 人体口腔及胃肠道，并在医药、替代能源、环境修复、生物技术、农业、生物防御及伦理学等各方面显示出重要价值。在酶学发展方面宏基因组学显示出强大的生命力，在发现新型酶以及有新型功能的已知酶方面已经取得一些进展[23]。
3.1应用宏基因组开发新型酶
传统的新型酶的筛选方法大大限制了筛选的广泛性和有效性[24]。宏基因组学则克服了这一限制，通过直接从环境中提取 DNA 样品，尽可能为后面的筛选提供更加全面和多样的基因资源，从而有效地提高了新酶的筛选效率。一般来说，新功能酶的筛选主要还是基于活性筛选。这种不依赖于序列的方法总体上可对所有新酶的活性或特异性进行鉴定[24]。虽然，基于序列的筛选方法可能不像功能筛选那样具有较强的目标性但通过有目的地设计杂交探针或 PCR引物 ,可一定程度地减少文库的容量，缩小筛选的范围[25]。
3.2应用宏基因发现新基因
由于自然界中大多数微生物物种及其生物量是未知的，其中存在大量不可培养的微生物，无法通过培养法进行研究，而宏基因组学的策略则突破了这一束缚。通过构建宏基因组文库，而且从中鉴定出的大多数基因将都是新的基因[8]。
3.3应用宏基因筛选医药
宏基因组学在现代医药学中扮演着极其重要的角色，对宏基因组文库进行功能筛选的重要目标是筛选在医药业中具有重要应用价值的产物[10]。如 Doreen . E等[26]对土壤宏基因组文库进行筛选，得到了2种新的抗生素 Turbomycin A和 B，这2种抗生素对革兰氏阴性和革兰氏阳性微生物菌表现出广谱的抗性。
4展望
宏基因组学研究将大大扩展我们对生命的了解，包括了解生命如何耐受极端环境、新的生物能源、生命进化以及微生物与环境之间的相互作用。宏基因组技术通过对环境 DNA的直接克隆, 为研究和利用占微生物种类 99 %以上的未可培养微生物提供了新的途径。随着新的科技方法的不断发展，宏基因组的应用范围将会越来越广泛。
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