白茶体外抗乙型肝炎病毒的研究.doc

白茶提取物体外抗乙型肝炎病毒的研究

目　录

摘要………………………………………………………………………………………………1
Abstract…………………………………………………………………………………………1
1 材料与方法……………………………………………………………………………………2
1.1 试验材料……………………………………………………………………………………2
1.2 试验试剂……………………………………………………………………………………2
1.2.1 试验试剂和药品……………………………………………………………………… 2
1.2.2 主要试剂的配制……………………………………………………………………… 3
1.3 试验仪器………………………………………………………………………………… 4
1.3.1 仪器设备…………………………………………………………………………………4
1.3.2 细胞培养物品的清洗及灭菌消毒…………………………………………………… 4
1.4 试验方法……………………………………………………………………………………4
1.4.1 HepG2.2.15细胞的培养…………………………………………………………………4
1.4.2 WTE的细胞毒性试验（MTT法）…………………………………………………………5
1.4.3 WTE对HBV抗原抑制的体外试验…………………………………………………………6
2 结果与分析……………………………………………………………………………………7
2.1 HepG 2.2.15细胞形态观察……………………………………………………………… 7
2.2 WTE的细胞毒性试验（MTT法）……………………………………………………………7
2.3 WTE对HBV抗原抑制的体外试验……………………………………………………………8
3 讨论……………………………………………………………………………………………9
3.1 WTE对细胞生长的低毒性作用…………………………………………………………… 9
3.2 WTE的抑制HBsAg、HBeAg表达的作用……………………………………………………10
参考文献……………………………………………………………………………………… 10
附件…………………………………………………………………………………………… 12
致谢…………………………………………………………………………………………… 14

主要英汉缩略对照表

英文缩写
英文全称
中文全称
WTE
White tea extract
白茶提取物
HBV
Hepatitis B Virus
乙型肝炎病毒
DMEM
Dulbecco's modification of Eagle's medium Dulbecco
细胞培养基
DMSO
Dimethyl sulfoxide
二甲基亚砜
ELISA
enzyme linked immunosorbent assay
酶联免疫吸附剂测定
FBS
Fetal Bovine Serum
胎牛血清
PBS
Phosphate Buffered Solution
磷酸盐缓冲液
HBsAg
Hepatitis B Surface Antigen
乙型肝炎表面抗原
HBeAg
Hepatitis B e-Antigen
乙型肝炎E抗原
HepG2.2.15

人肝癌细胞系
Hepes
2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid
羟乙基哌嗪乙硫磺酸
MTT
3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,
5-diphenyltetrazolium bromide
3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐（噻唑兰）
G418
Geneticin 418
筛选抗生素
3TC
Lamivudine
拉米夫定
PCR
Polymerase Chain Reaction
聚合酶链式反应
OD
Optical Density
光密度值
rpm
round per mineter
每分钟离心转数
TC50
The largest Non-toxic concententration
最大无毒浓度

摘要：本研究采用HepG2.2.15细胞模型，通过体外试验来研究白茶提取物（WTE）的抗乙型肝炎病毒功能，为进一步开发利用白茶资源提供理论依据，其研究结果表明：
1.WTE抑制50%细胞生长的浓度（TC50）为665.5µg/mL，高于其抑制病毒的200µg/mL的浓度，提示WTE对HepG2.2.15细胞的毒性较低，适合开发成药物或保健品。
2.WTE在200µg/mL浓度时对HBsAg表达抑制率达到40.70%，对HBeAg表达抑制率达到39.94%。结果提示WTE在体外实验中能够较有效地抑制HepG2.2.15细胞中HBsAg、HBeAg的分泌，从而抑制病毒的复制及表达。
关键词：白茶提取物；乙型肝炎病毒；HepG2.2.15细胞；细胞毒性试验；体外试验

Abstract：This research used the vitro experiments to study the white tea extract (WTE) of anti-hepatitis B virus functions, based on HepG2.2.15 cell models, in order to provide a theoretical basis for further development and utilization of the white tea resourses. The major results are as follows:
1.WTE was a little cellulotoxic, its TC50 towards HepG2.2.15 cells was only 665.5µg/mL,higher than the concentration of inhibiting virus (200µg/mL);it pointed out that WTE had a low toxicity to HepG2.2.15 cells, which can be suitable for exploiting drugs and health products.
2.When WTE concentration reached 200µg/mL, the inhibition ratio of HBsAg expression by WTE reached 40.70%, the inhibition ratio of HBeAg expression by WTE reached 39.94% .The results displayed that WTE could suppress HBsAg and HBeAg secretion efficiently in HepG2.2.15 cells in vitro experiments, in order to suppress the replication and expression of HBV.
Key words: WTE; HBV; HepG2.2.15 cell; cytotoxicity experiment; vitro experiment

白茶是我国的特种茶，六大茶类中的一颗璀璨明珠，我国是世界唯一的产地。“发如雪，似白眉，上下交错，素裹银装，熠熠生辉。美哉！雅哉！”这说的便是白茶[1]。因制法独特，仅有萎凋和干燥两道工序，成茶外表满披白毫，呈白色故称“白茶”。“神农尝百草，日遇七十二毒，得茶而解”，2000多年前《神农本草经》的一句记载，奠定了茶在药用方面的地位[2]。现代的静态生物化学通过对茶的研究表明，茶叶中共有700多种的内含物质[3]，其中咖啡碱约占茶叶总干物质的20%-30%，还有糖类、水、维生素、酶、矿物质等多种成分[2]。几十年来，国内外大量的研究表明，茶叶含有人体所必需的化学成分，含有对某些疾病具有显著疗效的物质，茶叶具有抗癌、抗衰老、抗氧化、抗辐射、降血糖、降血压、降血脂、抗菌、抗HIV、防蛀牙、延缓衰老等作用

[4,5,6,7]。白茶同其他茶类一样具有一定的保健药用价值，而且由于其独特的加工工艺和内含物变化等不同，其三降三抗的效果优于其他茶类[8]。
病毒性乙型肝炎（乙肝）是由乙型肝炎病毒（乙肝病毒，HBV）引起的传染病[9]。乙型肝炎病毒（HBV）具有明显的种属特异性，是目前所知道的最小的嗜肝DNA病毒，在易感染宿主细胞内易于附着、侵入和复制，并可长时间持续感染[10]。肝脏是HBV感染和复制的主要场所，故而肝细胞是HBV感染模型的首选细胞。目前用于HBV培养的细胞主要有人肝癌细胞系和HBV感染原代培养的肝细胞系两个模型[11]。人肝癌细胞主要有三个不同的细胞系建株：①PLC/CRF/5细胞系，②HepG2细胞系，③HepG2.2.15细胞系[12]。因HepG2.2.15细胞系可较长时间的维持HBV病毒的复制，故成为应用最广泛的乙型肝炎病毒细胞模型，常用于抗HBV感染基因治疗的研究[13,14]。慢性乙型肝炎是当前困扰人类健康最严重的问题之一，全球目前有4亿多慢性乙型肝炎病毒感染者，其中有超过75%分布在亚太地区，中国是乙型肝炎高发区，超过6亿人感染过乙肝病毒，慢性乙肝病毒携带者达10%以上[15]。慢性乙型肝炎的预后不良，将慢慢发展为肝硬化，最终可能发展为肝癌。乙型肝炎是导致急慢性肝炎、肝硬化、肝纤维化、肝癌的主要病因，对人类健康危害巨大，因此，寻找高效低毒的抗HBV药物已刻不容缓。长期以来，许多科学家和临床医学者对治疗慢性乙型肝炎的研究进行了不懈的努力，但仍然还没有一种治疗乙肝的特效药物[16,17]。
近年来国内外许多研究已经证实了茶提取物的抗病毒作用。《生命世界》2006年第3期摘录：天天喝茶可提高免疫力。文章中指出，哈佛大学的研究发现茶饮料中含有L-茶氨酸，当它进入人体被肝脏分解后，会转换成乙胺，继而激活机体T细胞，增强人体的免疫力[19]。白茶中的氨基酸含量高于普通茶一倍，富含人体所需的13种氨基酸[18]。已有文献曾报道白茶有消炎、杀菌、抗病毒及抗氧化、抗突变的活性物质；白茶中茶氨酸具有很强的提高机体免疫力的功能，可使机体内免疫细胞干扰素分泌量提高5倍，茶氨酸在人体肝脏内分解为乙胺，调动名为“伽马-德耳塔T形细胞”作出抵御外界侵害的反应，继而由T形细胞促进干扰素的分泌，形成人体抵御外界感染的“化学防线”，极大地提高机体抵御外界侵害的能力[19]。本试验采用HepG2.2.15细胞模型，通过体外试验，来研究白茶提取物（WTE）的抗乙型肝炎病毒功能。
1 材料与方法
1.1 试验材料
HepG2.2.15细胞株
1.2 试验试剂
1.2.1 试验试剂和药品
DMEM高糖培养基（含L-Gln）：北京索莱宝科技有限公司；

胰蛋白酶：北京索莱宝科技有限公司；
胎牛血清FBS：美国Hyclone公司；
二甲亚砜（DMSO）培养试剂：北京索莱宝科技有限公司；
青链霉素混合液：南京凯基生物科技发展有限公司；
PBS缓冲液：北京索莱宝科技有限公司；
G418：上海生工生物工程有限公司；
D-Hank，s：北京索莱宝科技有限公司；
Hepes：北京索莱宝科技有限公司；
MTT噻唑兰：北京索莱宝科技有限公司；
乙型肝炎病毒表面抗原酶联免疫试剂盒：上海科华生物技术有限公司；
乙型肝炎病毒E抗原酶联免疫试剂盒：上海科华生物技术有限公司；
贺普丁：中国苏州葛兰素史克制药有限公司；
1.2.2 主要试剂的配制：
1. 2.2.1 DMEM培养液的配制：
取一包DMEM高糖培养基粉，加入新鲜双蒸水800mL，再加入2.0g的 NaHCO3，4.765g的Hepes，搅拌，使充分溶解，用5.6%的NaHCO3将pH调至7.2左右，定容至1000mL，摇匀，过滤除菌，分装成小瓶。取少量培养液于细胞培养瓶中放至细胞培养箱中孵育检菌，其余-20℃保存备用，短期内使用则备存于4℃。
1.2.2.2 0.25%胰蛋白酶液的配制：
准确称取胰蛋白酶粉250mg和EDTA 20mg，加入90 mL双蒸水中，4℃冰浴搅拌混匀至完全溶解，避免产生泡沫，加水定容至100mL，用HCL调pH值至7.4，过滤除菌，分装，-20℃保存，短期内使用备存于4℃。
1.2.2.3 PBS的配制：
准确称取8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4、0.24g KH2PO4，加入800mL双蒸水，用玻棒搅拌，使充分溶解。用5.6%的NaHCO3将pH值调至7.4，加水定容至1000mL，分装后高压蒸汽灭菌，4℃保存备用。
1.2.2.4 G418液的配制：
准确称取380mg的G418粉剂溶于10mL PBS缓冲液中，待充分溶解后过滤除菌，分装成小瓶，-20℃保存备用。在培养细胞时向100mL培养液中加入1mL的G418液。
1.2.2.5 MTT溶液的配制：
准确称取50mg MTT粉，溶于10mL PBS缓冲液中，待充分溶解后，过滤除菌，分装，使浓度为5mg/mL，4℃避光保存备用。
1.2.2.6 细胞冻存液的配制：

表1 细胞冻存液配制表
DMEM高糖培养液
70mL
FBS
20mL
DMSO
10mL
1.2.2.7 3TC溶液的配制：
准确称取100mg的3TC贺普丁片，置于50mL PBS缓冲液中溶解，配成2mg/mL的母液，过滤除菌，分装成小瓶，-20℃保存备用。使用前以20倍稀释成浓度为0.1mg/mL的工作液即可。
1.2.2.8 含药培养基的配制：
将WTE以新鲜双蒸水配成浓度500mg/mL的母液，经0.45µm、0.22µm的微孔滤膜过滤除菌后，置4℃冰箱保存备用。实验时用配好的完全培养液将WTE母液稀释至所需浓度即可。
1.3 试验仪器
1.3.1 仪器设备
表2 仪器设备一览表
仪器名称
生产公司
CO2培养箱
Forma,Scien tific,inc
紫外可见分光光度计uLtrospec 2000 pro型
英国Biochrom.Ltd公司
KDC－160HR型高速冷冻离心机
科大创新股份有限公司
1-15台式高速离心机
Sigma公司
SZ-93自动双蒸纯水蒸馏器
上海亚荣生化仪器厂
芬兰雷勃MK3酶标仪
Thermo Labsystems公司
XSB-1A生物倒置显微镜
上海研润光机科技有限公司
PTC-200 PCR仪
MJ Research inc watertow
全自动洗板机
奥地利Anthos Labtec Instruments
冰箱（4℃，-20℃）
青岛海尔集团
超净工作台
深圳市科发实业有限公司
压力蒸汽灭菌器LDZX-30KBS
上海申安医疗器械厂
细胞培养瓶（25mL、50mL）
美国Costar
一次性注射器（1mL、10mL）
江苏康友医用器械有限公司

滤菌器和滤菌膜（0.22μm、0.45μm）
华美生物工程公司
1.3.2 细胞培养物品的清洗及灭菌消毒
微生物污染对于细胞培养影响极大, 与细胞培养有关的试剂和设备都必须经过严格的消毒灭菌才可使用。细胞实验物品的严格清洗及消毒灭菌是细胞培养成败的关键因素之一[20]，具体见附件。
1.4 试验方法
1.4.1 HepG2.2.15细胞的培养
（1）完全培养液的配制：
无菌条件下，于DMEM高糖培养液中加入380µg/mL的G418、10%FBS、100µg/mL青霉素、100µg/mL链霉素。于超净台下临用前配制，4℃保存备用。
（2）细胞复苏：
从液氮瓶中取出细胞冻存管，立即投入37℃水浴中缓慢摇动使之融化，一般在1min钟内完成，同时用75%酒精擦拭冻存管表面。在超净工作台内，从冻存管内吸出细胞悬液至无菌离心管中，加入约5mL完全培养液混匀，1000rpm下低速离心5min后弃去上清，接种于细胞培养瓶中，置细胞培养箱(37℃，5%CO2)中培养，隔日换培养液。
（3）细胞传代：
HepG2.2.15细胞为贴壁型生长细胞，需要每隔1天换液，每隔3天消化传代一次，按下列步骤操作：
①用吸管吸除培养瓶内的培养液；
②用D-Hank，s液轻轻冲洗瓶壁3次；
③加入0.25%胰蛋白酶消化液2mL，放回细胞培养箱中消化约4min；
④取出培养瓶，加入2滴完全培养液终止消化。用巴斯管将瓶内细胞轻轻吹打均匀后，将细胞悬液转入无菌带盖的离心管中，1000rpm离心4min；
⑤弃去上清液，加入2mL的完全培养液，反复地轻轻吹打，直至细胞均匀；
⑥细胞计数：取10µL的细胞悬液加入到10µL的0.4%台盼蓝染液，使混合均匀，后吸取10µL加入到细胞计数板中，电镜观察，数4大格后，根据下列公式计算出细胞数：
每mL细胞数=(4大格细胞数之和/4) ×2×104；
⑦细胞接种：将计数好的细胞悬液用配好的完全培养液将细胞浓度调至2×104/mL，后接种于细胞培养瓶中；
⑧置细胞培养箱(37℃，5%CO2)中培养，隔日换液。
（4）细胞冻存：
取对数生长期细胞，吸弃培养液，消化后置1000rpm离心，弃去上清。用配好的冻存液将细胞密度调至l×107/mL，分装于冻存管中，于4℃静置30min，再-20℃静置40min，再置于

-70℃超低温冰箱中过夜，次日投入液氮罐中冻存。
1.4.2 WTE的细胞毒性试验（MTT法）
细胞毒性实验采用MTT检验方法来检测WTE在体外对HepG2.2.15细胞的毒害作用。四甲基偶氮唑蓝染色剂是一种能接受氢原子的染料，其化学名为3-(4,5-二甲基噻唑-2)2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名为噻唑蓝，简称MTT。活细胞的线粒体中存在的一种琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原成难溶性的蓝紫色结晶物甲臜(Formazan)并沉积在细胞中，而死亡的细胞则不具有这种琥珀酸脱氢酶，MTT不会被还原。用二甲基亚砜（DMSO）溶解Formazan后，再用酶标仪在570nm波长处检测其光密度，可间接反映出活细胞的数目。此方法快速、简便、所需细胞数少。
细胞毒性试验：
（1）将HepG2.2.15细胞消化后，用完全培养液将细胞浓度调成2×l04/mL细胞悬液，吸入到96孔培养板中，100µL/孔，每个浓度共设3个复孔，置细胞培养箱(37℃，5%CO2)中培养。
（2）24 h后待细胞贴壁且生长良好，吸弃全部培养液，再加入6个终浓度为下表的WTE用药液100µL，并设空白对照孔：
表3 WTE用药液浓度
浓度
A
B
C
D
E
F
OT
空白
（µg/mL）
800
200
50
12.5
3.1
0.8
原液
空白
（3）连续培养72h后，在培养结束前5h，每孔加入10µL的 MTT，于细胞培养箱(37℃，5%CO2)中继续培养。
（4）5 h后小心吸弃各孔的上清液，每孔加入DMSO 100µL，置微量振荡器振荡4min，使结晶紫（Formazan）完全溶解掉。置于自动酶标仪(设定检测波长570nm，参考波长630nm)读取各孔OD值，记录结果。
（5）计算WTE对HepG2.2.15细胞生长的抑制百分率，并参照Reed-Muench法[21]计算出半数细胞毒性浓度(TC50)。
抑制率(%)=(对照孔平均A值-加药孔平均A值) / (对照孔平均A值-空白孔A值×100％
半数毒性浓度(TC50)=Antilog[1ogB+(50-B)的抑制百分率／(A-B)的抑制百分率×C]，(A≥抑制50％药物浓度，B≤抑制50％药物浓度，C=log稀释倍数)。
1.4.3 WTE对HBV抗原抑制的体外试验
1.4.3.1 含药培养液的配置：

将WTE以新鲜三蒸水配成400µg/mL的母液，经0.22µm的一次性过滤头过滤除菌，置4℃冰箱保存备用，临用时用完全培养液将其2倍稀释成以下4个终浓度的应用液：400µg/mL、200µg/mL、100µg/mL、50µg/mL。
1.4.3.2 WTE对HBV抗原抑制的体外试验：
将HepG2.2.15细胞消化后，用完全培养液将细胞浓度调成2×104/mL的细胞悬液，加入到24孔细胞培养板中，1000µL/孔，每个浓度共设3个复孔，置细胞培养箱(37℃，5% CO2)中培养。隔日待细胞贴壁且生长良好，吸去培养液，然后分别加入下表中药物配制的各浓度的完全培养液1000µL，每个浓度设3个复孔，置细胞培养箱(37℃，5% CO2)中培养。等量的完全培养液作空白对照，用已证实确实有效的3TC培养液作阳性对照[22,23]。
表4 药物及其浓度配制表
孔号
1
2
3
4
5
6
7
8
药物
WTE（µg/mL）
3TC（µM/mL）
空白
浓度
50
100
200
400
0.2
2
20

在连续培养72h后，吸取细胞培养液分别加于1.5mL无菌Eppnedorf管中，于-20℃保存待检。再次加入上述不同浓度的药物培养液继续培养。
在再次培养72h后，吸取细胞培养液分别加于1.5mL无菌Eppnedorf管中，于-20℃保存待检。
1.4.3.3 ELISA法检测
将-20℃保存的细胞培养液用同时同批乙型肝炎病毒表面抗原、E抗原酶联免疫试剂盒检测HBsAg和HBeAg的效价。
（1）实验准备：从冷藏环境中取出试剂盒，在室温下平衡30min，同时待测样品也置室温下平衡30min，另外将浓缩洗涤液作1:20稀释。
（2）加待测标本：其中每孔加入50µL的细胞培养液，分别设HBsAg，HBeAg阳性对照和阴性对照组各2孔，并设空白对照1孔。
（3）加酶结合物：每孔加入50µL酶结合物，其中空白对照孔不加，充分混匀后，封板，置37℃下30min。
（4）洗板：吸弃反应板孔内液体，甩干；每孔注满洗涤液，静置10s后，吸弃孔内洗涤液，拍干。以上步骤重复5次。
（5）加显色剂：先加入显色剂A，50µL/孔；再加入显色剂B，50µL/孔；充分混匀后，封板，置于

37℃下避光孵育15min。
（6）终止反应：加入反应终止液50µL/孔，充分混匀。
（7）测定：以空白孔调零，置于自动酶标仪读取各孔OD值(设定检测波长450nm，参考波长630nm)，做好结果记录。
计算WTE对HBsAg，HBeAg表达的抑制百分率：
WTE对抗原的抑制百分率=[l-实验孔抗原OD值/对照孔抗原OD值]×100%
2 结果与分析
2.1 HepG 2.2.15细胞形态观察
电镜下HepG2.2.15细胞形态如下图1、2所示：

图1 10×显微镜下观察的HepG2.2.15细胞 图2 40×显微镜下观察的HepG2.2.15细胞
由图1、2可观察到HepG2.2.15细胞为贴壁细胞，呈梭形状或多角形状。
2.2 WTE的细胞毒性试验（MTT法）
MTT试验结果显示TC50=665.5 µg/mL，结果见表5，提示WTE对HepG2.2.15细胞的毒性较低。
表5 WTE对HepG2.2.15细胞的毒性作用（±S，n=6）
浓度（µg/mL）
OD
存活率（%）
抑制率（%）
TC50（µg/mL）
空白组
0.927±0.031

665.5
800
0.487±0.043
46.3
53.7
200
0.622±0.151
62.8
37.2
50
0.765±0.046
80.2
19.8
12.5
0.819±0.195
86.8
13.2
3.1
0.905±0.236
97.3
2.7
2.3 WTE对HBV抗原抑制的体外试验
各组用药后HepG2.2.15细胞系HBsAg、HBeAg的浓度皆有下降的趋势，说明对HBsAg、HBeAg表达均有一定的抑制作用。其中作用144h后，3TC在20µM/mL浓度时对HBsAg表达抑制率达到53.42%，对HBeAg表达抑制率达到56.32%；WTE在200

µg/mL浓度时对HBsAg表达抑制率达到40.70%，对HBeAg表达抑制率达到39.94%。结果见表6，图3、4。
表6 WTE对HepG2.2.15细胞系HBsAg、HBeAg表达的抑制作用（±S，n=3）
组别
浓度
72h
144h
HBsAg
HBeAg
HBsAg
HBeAg
空白

0.892±0.024
0.512±0.033
0.833±0.041
0.696±0.082
3TC组
（µM/mL）
0.2
0.783±0.036
0.462±0.065**
0.712±0.112**
0.613±0.053**
2
0.589±0.047**
0.356±0.048**
0.502±0.043**
0.438±0.024**
20
0.447±0.076**
0.245±0.027**
0.388±0.031**
0.304±0.038**
WTE
（µg/mL）
50
0.805±0.033**
0.483±0.082*
0.732±0.049**
0.621±0.057**
100
0.698±0.065**
0.403±0.049**
0.631±0.024**
0.514±0.049**
200
0.573±0.027**
0.342±0.114**
0.494±0.033**
0.418±0.043**
400
0.621±0.044**
0.378±0.048**
0.562±0.066**
0.489±0.041**
注：与空白组对比，* P<0.05；** P<0.01

图3 3TC、WTE对HBsAg的抑制作用

图4 3TC、WTE对HBeAg的抑制作用
3 讨论
在过去的几十年中，人们对于茶提取物能够抗炎症、抗氧化、抗病毒等生物学活性表现了极大的研究兴趣。本实验通过验证WTE在体外人肝癌细胞系HepG2.2.15中的抗乙肝病毒研究，表明了WTE不仅在动物体内能够通过提高机体内干扰素分泌等因素来抑制乙型肝炎病毒的复制和表达，同时在体外细胞中也可以干扰病毒复制从而达到抗乙肝病毒的目的。
3.1 WTE对细胞生长的低毒性作用
MTT法是一种快速、简便的用颜色反应的方法来检测细胞存活和增殖的方法。MTT法的检测原理为：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为不溶于水的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞则无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在570nm波长处测定其光吸收值，以此间接反映出活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛应用于一些生物活性因子的活性检测、细胞毒性试验、大规模的抗肿瘤药物筛选以及肿瘤放射敏感性测定等，其特点是灵敏度高、快速、经济、易自动化、无放射性污染等，而且能够在比较短的时间内对药物进行筛选和评价，省去了一些繁琐的实验步骤，而且取得的数据客观可靠，是比较理想的实验方法。
本实验应用MTT法来观察WTE在抑制HBV DNA复制的同时对HepG2.2.15细胞本身的生长是否有影响。结果显示，WTE抑制50%细胞生长的浓度（TC50）为665.5µg/mL，高于其抑制病毒的200µg/mL的浓度，提示WTE对HepG2.2.15细胞的毒性较低，适合开发成药物或保健品。
3.2 WTE的抑制HBsAg、HBeAg表达的作用
研究结果显示，WTE不仅可以抑制HBV DNA的复制，而且可以一定程度上抑制乙肝病毒抗原的表达。结果表明，在一定浓度范围内，WTE随着药物浓度的加大，其对乙肝病毒抗原HBsAg、HBeAg表达的抑制作用越明显。当WTE浓度为200µg/mL、用药144h后，HBsAg、HBeAg的抑制率可达40%左右。但是浓度为400 µg/mL、用药144h后，HBsAg、HBeAg的抑制率却稍降，这可能与其接近半数毒性浓度（665.5

µg/mL）有关。
研究结果证实的WTE对于HBeAg表达有较强的抑制作用，这一点明显不同于核苷类似物。HBeAg并不是病毒复制所必需的，到目前为止，人们对于它对病毒的复制、感染和发病的作用并不十分清楚，最近的几项研究结果显示，HBeAg可能是作为一个免疫调节因子在HBV的慢性持续感染中发挥重要作用，并且和造成感染者的免疫耐受状态有关。前人的多项研究结果表明，茶提取物可以大大提高人体的免疫力，本论文的研究结果暗示WTE可能在打破乙肝免疫耐受状态，进而激发人体的免疫系统方面有潜在的应用价值。
本实验采用HepG2.2.15细胞模型来检验WTE的抗HBV细胞模型。以细胞模型来检验并评价抗乙肝病毒药物，比动物模型更省时、方便、成本低，且不受机体免疫等因素的干扰。本实验结果表明，WTE在体外实验中能够较有效地抑制HBsAg、HBeAg的分泌，从而抑制病毒的复制及表达。

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附件
细胞培养所需器材的清洗及灭菌消毒
一、细胞培养物品的清洗
（1） 超净工作台使用前要用75%的酒精擦洗台面,再用紫外线灭菌灯照射30min，在关闭紫外灭菌灯后开启风机,运转5min后才能进行培养操作。另外，细胞室及传递窗也同样要进行紫外杀菌。
（2） 玻璃器皿:新使用的玻璃器皿经初步刷洗后要用5%的稀HCL溶液浸泡过夜,二次使用的玻璃器皿则应立即放入清水中浸泡4h以上,再用洗涤剂和专用软毛刷来刷洗, 刷洗时应注意避免损坏器皿表面的光洁度, 重复几次刷洗完后要将洗涤剂彻底冲洗干净,晾干备用；刷洗后还要再用次强液浸泡过夜（配方为:重铬酸120g、次硫酸200mL、蒸馏水1000mL）。注意在浸泡时必须将玻璃器皿完全浸没，不能留有气泡；玻璃器皿浸泡过夜后，先用流水反复冲洗，至少重复10次，然后还要用蒸馏水漂洗5次以上，再置于烘箱内烘干备用；
（3）胶塞、盖子：首次使用的胶塞内会有许多滑石粉，此时应该先用自来水反复冲洗干净，再进行常规性清洗；而使用后的盖子、胶塞应该及