白茶体外抗乙型肝炎病毒的研究.doc
《白茶体外抗乙型肝炎病毒的研究.doc》由会员分享,可在线阅读,更多相关《白茶体外抗乙型肝炎病毒的研究.doc(19页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、白茶提取物体外抗乙型肝炎病毒的研究目录摘要1Abstract11 材料与方法21.1 试验材料21.2 试验试剂21.2.1 试验试剂和药品 21.2.2 主要试剂的配制 31.3 试验仪器 41.3.1 仪器设备41.3.2 细胞培养物品的清洗及灭菌消毒 41.4 试验方法41.4.1 HepG2.2.15细胞的培养41.4.2 WTE的细胞毒性试验(MTT法)51.4.3 WTE对HBV抗原抑制的体外试验62 结果与分析72.1 HepG 2.2.15细胞形态观察 72.2 WTE的细胞毒性试验(MTT法)72.3 WTE对HBV抗原抑制的体外试验83 讨论93.1 WTE对细胞生长的低毒
2、性作用 93.2 WTE的抑制HBsAg、HBeAg表达的作用10参考文献 10附件 12致谢 14主要英汉缩略对照表英文缩写英文全称中文全称WTEWhite tea extract白茶提取物HBVHepatitis B Virus乙型肝炎病毒DMEMDulbeccos modification of Eagles medium Dulbecco细胞培养基DMSODimethyl sulfoxide二甲基亚砜ELISAenzyme linked immunosorbent assay酶联免疫吸附剂测定FBSFetal Bovine Serum胎牛血清PBSPhosphate Buffered
3、Solution磷酸盐缓冲液HBsAgHepatitis B Surface Antigen乙型肝炎表面抗原HBeAgHepatitis B e-Antigen乙型肝炎E抗原HepG2.2.15人肝癌细胞系Hepes2-4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinylethanesulfonic acid 羟乙基哌嗪乙硫磺酸MTT3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(噻唑兰)G418Geneticin 418筛选抗生素3TCLamivudi
4、ne拉米夫定PCRPolymeraseChainReaction聚合酶链式反应ODOptical Density光密度值rpmround per mineter每分钟离心转数TC50The largest Non-toxic concententration最大无毒浓度摘要:本研究采用HepG2.2.15细胞模型,通过体外试验来研究白茶提取物(WTE)的抗乙型肝炎病毒功能,为进一步开发利用白茶资源提供理论依据,其研究结果表明:1.WTE抑制50%细胞生长的浓度(TC50)为665.5g/mL,高于其抑制病毒的200g/mL的浓度,提示WTE对HepG2.2.15细胞的毒性较低,适合开发成药物或
5、保健品。2.WTE在200g/mL浓度时对HBsAg表达抑制率达到40.70%,对HBeAg表达抑制率达到39.94%。结果提示WTE在体外实验中能够较有效地抑制HepG2.2.15细胞中HBsAg、HBeAg的分泌,从而抑制病毒的复制及表达。关键词:白茶提取物;乙型肝炎病毒;HepG2.2.15细胞;细胞毒性试验;体外试验Abstract:This research used the vitro experiments to study the white tea extract (WTE) of anti-hepatitis B virus functions, based on HepG
6、2.2.15 cell models, in order to provide a theoretical basis for further development and utilization of the white tea resourses. The major results are as follows:1.WTE was a little cellulotoxic, its TC50 towards HepG2.2.15 cells was only 665.5g/mL,higher than the concentration of inhibiting virus (20
7、0g/mL);it pointed out that WTE had a low toxicity to HepG2.2.15 cells, which can be suitable for exploiting drugs and health products.2.When WTE concentration reached 200g/mL, the inhibition ratio of HBsAg expression by WTE reached 40.70%, the inhibition ratio of HBeAg expression by WTE reached 39.9
8、4% .The results displayed that WTE could suppress HBsAg and HBeAg secretion efficiently in HepG2.2.15 cells in vitro experiments, in order to suppress the replication and expression of HBV.Key words: WTE; HBV; HepG2.2.15 cell; cytotoxicity experiment; vitro experiment白茶是我国的特种茶,六大茶类中的一颗璀璨明珠,我国是世界唯一的产
9、地。“发如雪,似白眉,上下交错,素裹银装,熠熠生辉。美哉!雅哉!”这说的便是白茶1。因制法独特,仅有萎凋和干燥两道工序,成茶外表满披白毫,呈白色故称“白茶”。“神农尝百草,日遇七十二毒,得茶而解”,2000多年前神农本草经的一句记载,奠定了茶在药用方面的地位2。现代的静态生物化学通过对茶的研究表明,茶叶中共有700多种的内含物质3,其中咖啡碱约占茶叶总干物质的20%-30%,还有糖类、水、维生素、酶、矿物质等多种成分2。几十年来,国内外大量的研究表明,茶叶含有人体所必需的化学成分,含有对某些疾病具有显著疗效的物质,茶叶具有抗癌、抗衰老、抗氧化、抗辐射、降血糖、降血压、降血脂、抗菌、抗HIV、防
10、蛀牙、延缓衰老等作用4,5,6,7。白茶同其他茶类一样具有一定的保健药用价值,而且由于其独特的加工工艺和内含物变化等不同,其三降三抗的效果优于其他茶类8。病毒性乙型肝炎(乙肝)是由乙型肝炎病毒(乙肝病毒,HBV)引起的传染病9。乙型肝炎病毒(HBV)具有明显的种属特异性,是目前所知道的最小的嗜肝DNA病毒,在易感染宿主细胞内易于附着、侵入和复制,并可长时间持续感染10。肝脏是HBV感染和复制的主要场所,故而肝细胞是HBV感染模型的首选细胞。目前用于HBV培养的细胞主要有人肝癌细胞系和HBV感染原代培养的肝细胞系两个模型11。人肝癌细胞主要有三个不同的细胞系建株:PLC/CRF/5细胞系,Hep
11、G2细胞系,HepG2.2.15细胞系12。因HepG2.2.15细胞系可较长时间的维持HBV病毒的复制,故成为应用最广泛的乙型肝炎病毒细胞模型,常用于抗HBV感染基因治疗的研究13,14。慢性乙型肝炎是当前困扰人类健康最严重的问题之一,全球目前有4亿多慢性乙型肝炎病毒感染者,其中有超过75%分布在亚太地区,中国是乙型肝炎高发区,超过6亿人感染过乙肝病毒,慢性乙肝病毒携带者达10%以上15。慢性乙型肝炎的预后不良,将慢慢发展为肝硬化,最终可能发展为肝癌。乙型肝炎是导致急慢性肝炎、肝硬化、肝纤维化、肝癌的主要病因,对人类健康危害巨大,因此,寻找高效低毒的抗HBV药物已刻不容缓。长期以来,许多科学
12、家和临床医学者对治疗慢性乙型肝炎的研究进行了不懈的努力,但仍然还没有一种治疗乙肝的特效药物16,17。近年来国内外许多研究已经证实了茶提取物的抗病毒作用。生命世界2006年第3期摘录:天天喝茶可提高免疫力。文章中指出,哈佛大学的研究发现茶饮料中含有L-茶氨酸,当它进入人体被肝脏分解后,会转换成乙胺,继而激活机体T细胞,增强人体的免疫力19。白茶中的氨基酸含量高于普通茶一倍,富含人体所需的13种氨基酸18。已有文献曾报道白茶有消炎、杀菌、抗病毒及抗氧化、抗突变的活性物质;白茶中茶氨酸具有很强的提高机体免疫力的功能,可使机体内免疫细胞干扰素分泌量提高5倍,茶氨酸在人体肝脏内分解为乙胺,调动名为“伽
13、马-德耳塔T形细胞”作出抵御外界侵害的反应,继而由T形细胞促进干扰素的分泌,形成人体抵御外界感染的“化学防线”,极大地提高机体抵御外界侵害的能力19。本试验采用HepG2.2.15细胞模型,通过体外试验,来研究白茶提取物(WTE)的抗乙型肝炎病毒功能。1 材料与方法1.1 试验材料HepG2.2.15细胞株1.2 试验试剂1.2.1 试验试剂和药品DMEM高糖培养基(含L-Gln):北京索莱宝科技有限公司;胰蛋白酶:北京索莱宝科技有限公司;胎牛血清FBS:美国Hyclone公司;二甲亚砜(DMSO)培养试剂:北京索莱宝科技有限公司;青链霉素混合液:南京凯基生物科技发展有限公司;PBS缓冲液:北
14、京索莱宝科技有限公司;G418:上海生工生物工程有限公司;D-Hank,s:北京索莱宝科技有限公司;Hepes:北京索莱宝科技有限公司;MTT噻唑兰:北京索莱宝科技有限公司;乙型肝炎病毒表面抗原酶联免疫试剂盒:上海科华生物技术有限公司;乙型肝炎病毒E抗原酶联免疫试剂盒:上海科华生物技术有限公司;贺普丁:中国苏州葛兰素史克制药有限公司;1.2.2 主要试剂的配制:1. 2.2.1 DMEM培养液的配制:取一包DMEM高糖培养基粉,加入新鲜双蒸水800mL,再加入2.0g的 NaHCO3,4.765g的Hepes,搅拌,使充分溶解,用5.6%的NaHCO3将pH调至7.2左右,定容至1000mL,
15、摇匀,过滤除菌,分装成小瓶。取少量培养液于细胞培养瓶中放至细胞培养箱中孵育检菌,其余-20保存备用,短期内使用则备存于4。1.2.2.2 0.25%胰蛋白酶液的配制:准确称取胰蛋白酶粉250mg和EDTA 20mg,加入90 mL双蒸水中,4冰浴搅拌混匀至完全溶解,避免产生泡沫,加水定容至100mL,用HCL调pH值至7.4,过滤除菌,分装,-20保存,短期内使用备存于4。1.2.2.3 PBS的配制:准确称取8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4、0.24g KH2PO4,加入800mL双蒸水,用玻棒搅拌,使充分溶解。用5.6%的NaHCO3将pH值调至7.4,加水定容
16、至1000mL,分装后高压蒸汽灭菌,4保存备用。1.2.2.4 G418液的配制:准确称取380mg的G418粉剂溶于10mL PBS缓冲液中,待充分溶解后过滤除菌,分装成小瓶,-20保存备用。在培养细胞时向100mL培养液中加入1mL的G418液。1.2.2.5 MTT溶液的配制:准确称取50mg MTT粉,溶于10mL PBS缓冲液中,待充分溶解后,过滤除菌,分装,使浓度为5mg/mL,4避光保存备用。1.2.2.6 细胞冻存液的配制:表1 细胞冻存液配制表DMEM高糖培养液70mLFBS20mLDMSO10mL1.2.2.7 3TC溶液的配制:准确称取100mg的3TC贺普丁片,置于50
17、mL PBS缓冲液中溶解,配成2mg/mL的母液,过滤除菌,分装成小瓶,-20保存备用。使用前以20倍稀释成浓度为0.1mg/mL的工作液即可。1.2.2.8 含药培养基的配制:将WTE以新鲜双蒸水配成浓度500mg/mL的母液,经0.45m、0.22m的微孔滤膜过滤除菌后,置4冰箱保存备用。实验时用配好的完全培养液将WTE母液稀释至所需浓度即可。1.3 试验仪器1.3.1 仪器设备表2 仪器设备一览表仪器名称生产公司CO2培养箱Forma,Scien tific,inc紫外可见分光光度计uLtrospec 2000 pro型英国Biochrom.Ltd公司KDC160HR型高速冷冻离心机科大
18、创新股份有限公司1-15台式高速离心机Sigma公司SZ-93自动双蒸纯水蒸馏器上海亚荣生化仪器厂芬兰雷勃MK3酶标仪ThermoLabsystems公司XSB-1A生物倒置显微镜上海研润光机科技有限公司PTC-200 PCR仪MJ Research inc watertow全自动洗板机奥地利Anthos Labtec Instruments冰箱(4,-20)青岛海尔集团超净工作台深圳市科发实业有限公司压力蒸汽灭菌器LDZX-30KBS上海申安医疗器械厂细胞培养瓶(25mL、50mL)美国Costar一次性注射器(1mL、10mL)江苏康友医用器械有限公司滤菌器和滤菌膜(0.22m、0.45m
19、)华美生物工程公司1.3.2 细胞培养物品的清洗及灭菌消毒微生物污染对于细胞培养影响极大, 与细胞培养有关的试剂和设备都必须经过严格的消毒灭菌才可使用。细胞实验物品的严格清洗及消毒灭菌是细胞培养成败的关键因素之一20,具体见附件。1.4 试验方法1.4.1 HepG2.2.15细胞的培养(1)完全培养液的配制:无菌条件下,于DMEM高糖培养液中加入380g/mL的G418、10%FBS、100g/mL青霉素、100g/mL链霉素。于超净台下临用前配制,4保存备用。(2)细胞复苏:从液氮瓶中取出细胞冻存管,立即投入37水浴中缓慢摇动使之融化,一般在1min钟内完成,同时用75%酒精擦拭冻存管表面
20、。在超净工作台内,从冻存管内吸出细胞悬液至无菌离心管中,加入约5mL完全培养液混匀,1000rpm下低速离心5min后弃去上清,接种于细胞培养瓶中,置细胞培养箱(37,5%CO2)中培养,隔日换培养液。(3)细胞传代:HepG2.2.15细胞为贴壁型生长细胞,需要每隔1天换液,每隔3天消化传代一次,按下列步骤操作:用吸管吸除培养瓶内的培养液;用D-Hank,s液轻轻冲洗瓶壁3次;加入0.25%胰蛋白酶消化液2mL,放回细胞培养箱中消化约4min;取出培养瓶,加入2滴完全培养液终止消化。用巴斯管将瓶内细胞轻轻吹打均匀后,将细胞悬液转入无菌带盖的离心管中,1000rpm离心4min;弃去上清液,加
21、入2mL的完全培养液,反复地轻轻吹打,直至细胞均匀;细胞计数:取10L的细胞悬液加入到10L的0.4%台盼蓝染液,使混合均匀,后吸取10L加入到细胞计数板中,电镜观察,数4大格后,根据下列公式计算出细胞数:每mL细胞数=(4大格细胞数之和/4) 2104;细胞接种:将计数好的细胞悬液用配好的完全培养液将细胞浓度调至2104/mL,后接种于细胞培养瓶中;置细胞培养箱(37,5%CO2)中培养,隔日换液。(4)细胞冻存:取对数生长期细胞,吸弃培养液,消化后置1000rpm离心,弃去上清。用配好的冻存液将细胞密度调至l107/mL,分装于冻存管中,于4静置30min,再-20静置40min,再置于-
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 白茶 体外 乙型肝炎 病毒 研究
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【快乐****生活】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【快乐****生活】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。