酵母型真菌的微生物学检验.doc

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酵母型真菌的微生物学检验
1．检验程序 深部真菌检验程序见图23-8。

2. 标本采集  根据感染部位的不同，采集不同的标本。采集标本时应避免病灶周围正常菌群污染。对于疑似隐球菌性脑膜炎患者，以腰椎穿刺术无菌采集脑脊液3～5ml，特殊情况可采用小脑延髓池或脑室穿刺术，标本采集后应立即送检。
3．标本直接检查
(1)直接显微镜检查：取标本直接涂片，革兰染色后镜检，显微镜下见到革兰阳性、圆形或卵圆形菌体或孢子及假菌丝(图23-6)，可确认为念珠菌感染。克柔念珠菌可见假菌丝成对称分枝，有细长的芽生孢子。光滑念珠莳镜下可见卵圆形芽生孢子，细胞尖端单芽，无真假菌丝，不产生厚壁孢子。用患者脑脊液作墨汁负染色检查是诊断隐球菌脑膜炎最简便、快速的方法。常规细胞染色可发现隐球菌，但易误诊和漏诊。如用PAS染色后新生隐球菌呈红色。

(2)G试验：也称螯试验，可测定1-3-β-D-葡聚糖，后者是多种不同种类真菌细胞壁的共有成分，部分可激活马蹄蟹的协同凝集酶-G因子，用显色反应经分光光度计可测定其浓度。血液及无菌体液中检出1-3-β-D-葡聚糖为深部真菌，如念珠菌、曲霉菌和酵母菌等感染的标志，但不能确定为何种深部真菌感染。
(3)抗原检测：取患者血清做ELISA、免疫印迹法等检测白念珠菌抗原，如烯醇化酶、甘露聚糖抗原及念珠菌热敏抗原。
(4)抗体检测：早期诊断可采用患者血清作ELISA夹心法、免疫酶斑点试验，方法简便、快速。也可用乳胶凝集试验和对流免疫电泳试验等检测血清中抗白念珠菌抗体。
(5)核酸检测：用PCR法将白念珠菌DNA分子扩增后以分子探针检测，具有较好的敏感性和特异性。现有学者提出用短肽噬菌体展示技术与ELISA结合，高分辨率熔解曲线与真菌通用引物PCR结合鉴定白念珠菌及其他念珠菌。
4．分离培养 
 将标本接种在沙保弱培养基上，25℃或37℃培养1～4天后，白念珠菌可在培养基表面出现奶油色类酵母型菌落，镜检可见假菌丝和芽生孢子。热带念珠菌在沙保弱培养基上形成色暗而干燥的菌落。克柔念珠菌在沙保弱琼脂培养基上25℃培养2～3天，呈扁平、干燥、灰黄色、可见皱褶菌落。光滑念珠菌在沙保弱培养基上25～37℃培养2～3天，形成奶油色乳酪样菌落。
将标本接种在沙保弱培养基上，病原性隐球菌在25℃和37℃培养的可生长，而非病原性隐球菌在37~C时不生长。培养2～5天后观察菌落形态特点，并取菌落作印度墨汁负染色镜检。
5. 鉴定
(1)念珠菌
1)芽管形成试验：将念珠菌接种于0．2~0．5ml人或动物血清中，37℃培养1．5～4小时，镜检观察有无芽管形成。白念珠菌可形成芽管，但并非所有的白色念珠菌都形成芽管，其他念珠菌一般不形成芽管。试验时应设立阳性对照(白色念珠菌)和阴性对照(热带念珠菌)。但热带念珠菌在血清中培养6小时或更久时也可形成芽管，所以要注意试验培养时间。
2)厚膜孢子形成试验：将念珠菌接种于玉米粉培养基25℃培养1～2天后，仅白色念珠菌在菌丝顶端、侧缘或中间形成厚膜孢子。
3)糖同化或发酵试验：念球菌凡能发酵某种糖，一定能同化该糖，故只需做那些不被发酵糖的同化试验。糖发酵试验是将培养物接种糖发酵管，25℃培养，一般观察2～3天，对不发酵或弱发酵管可延长至10天或2～4周。同化试验所有的基础培养基含(NH4)2SO4、KH2P04、MgS04•7H2O、CaCl2•2H20、NaCl和酵母浸膏，试验时再分别加入各种糖。同时以葡萄糖和基础培养基作对照。观察结果时要观察有无酵母生长或液体培养基是否变混浊。各种念珠菌糖发酵及同化试验结果日表23-2。

4)氯化三苯基四氮唑反应：取沙保弱培养基上的菌落接种至加入0．05g/L氯化三苯基四氮唑(TZC)的葡萄糖蛋白胨琼脂，热带念珠菌在此培养基上生长后使培养基变为深红色或紫色，而自念珠菌不使培养基变色(淡红)，其他念珠菌使培养其变为红色。
现在临床用商品化的显色培养基可快速鉴定白念珠菌和其他念珠菌(图23-9)。在显色培养基上，白念珠菌的菌落呈绿色或翠绿色，热带念珠菌呈蓝灰色或铁蓝色，克柔念珠菌呈粉红色或淡紫色，光滑念珠菌则形成白色或紫红色菌落。

5)动物试验：将念珠菌悬液注射1ml于家兔耳静脉或注射0．2ml于小白鼠尾静脉，观察5～7天，注意动物是否死亡。剖检时如发现脏器有多种小脓肿，即为白念珠菌感染。其池念珠菌对动物无致病性。
(2)隐球嗣属
1)酚氧化酶试验：将菌落接种L-多巴枸橼酸铁和咖啡酸培养基中，经2～5天培养，新生隐球菌呈棕黑色菌落。用已知新生隐球菌和浅白隐球菌分别作阳性和阴性对照。
2)脲酶试验：新生隐球菌能产生脲酶，可分解尿素琼脂培养基的尿素形成NH4和CO2。使培养基pH升高，从而培养基由黄色变为粉红色。白念珠菌为阴性。
3)糖同化及发酵试验：新生隐球菌能同化葡萄糖、半乳糖、蔗糖和肌醇和棉子糖，但不能发酵糖和醇类，硝酸盐还原试验阴性。非致病性隐球菌则不能同化肌醇。
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