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代谢工程在工业微生物育种中的应用
摘 要：传统的诱变育种仍是目前发酵工业菌种选育中最常用的育种技术，以基因工程技术为主的多元化育种方式的发展，为代谢途径操作引入了全新的理念和方法，使代谢工程得以发展。代谢工程是对细胞代谢网络的代谢流量及代谢控制进行定量地、系统地分析，并通过DNA重组技术和相关的遗传学手段对微生物细胞进行代谢改造，提高其目的产物代谢量。本文论述了微生物代谢工程的理论基础及其在发酵工业微生物育种中的应用现状。
关键词：代谢工程；代谢途径；菌种选育
发酵工业自20世纪40年代发展至今，在青霉素等抗生素的发酵生产、赖氨酸等一系列氨基酸的发酵生产以及核苷酸、有机酸等物质的发酵产业发展中起了极其重要的作用。在工业微生物育种的过程中，对个别基因进行改造的经典基因工程技术不能保证对微生物代谢网络结构和功能的准确分析和高效利用，影响了相关行业的生产效率的稳定和经济效益的提高。目前，几乎所有重要工业微生物模式菌种的基因组全序列已经或即将公布，转录组、蛋白质组、代谢组、通量组等数据资源正在迅速扩展。充分利用组学数据中包含的有用信息，可以更有效地改造和控制细胞性能、提高底物利用以及产品的产率、改善微生物工业适应性，促进工业生物技术发展[1]。
菌种筛选和持续不断的改良贯彻于发酵生产过程的始终，以基因工程为核心的现代生物技术正越来越显示出其在菌种改良上的魅力，将最终成为微生物育种的主导技术[2]。建立在重组DNA技术基础之上的代谢工程技术，可以更容易地选择菌种的改良靶点，构建具有新的代谢途径的微生物细胞，提高其发酵性能，生产特定目的产物，从而可以推动发酵工业的发展。
一、代谢工程概述
代谢工程（Metabolic engineering），又称途径工程（Pathway engineering），是指利用生物学原理，系统地分析细胞代谢网络，并通过DNA重组技术合理设计细胞代谢途径，通过遗传修饰，完成细胞特性改造的应用性学科。1974年，Chakrabarty在假单胞菌属的两个菌种中分别引入几个稳定的重组质粒，从而提高了对樟脑和萘等复杂有机物的降解活性，这成为代谢工程技术的第一个应用实例。代谢工程的概念是1991年由生化工程专家

James E. Bailey首次提出的。
生物体的代谢过程在不打破其平衡的情况下，都是以满足自身生长发育为基础的，利用调控网络经济划算地生成代谢产物。如果需要积累某种代谢产物，就要打破生物体原有的代谢平衡状态，从代谢网络着手改变细胞的代谢途径，代谢网络是将细胞的生化反应以网络整体来考虑。代谢工程的设计主要是在对细胞的整个代谢网络代谢流进行定性、定量分析的基础上，改变代谢流、扩展代谢途径、构建新的代谢途径。由于代谢工程的核心内容是对细胞代谢网络进行功利性修饰，所以要完成这一过程，首先要对细胞的分解代谢和合成代谢中的多步级联反应进行合理设计，然后利用重组DNA技术强化和(或)灭活控制代谢途径的相关基因。从这一点上来说，代谢工程也是基因工程的一个重要分支，而且通常是一个多基因的基因工程[2]。
近年来，随着组学（基因组、蛋白质组、代谢组等）和高通量筛选技术的大幅发展，让人们可以逐渐了解细胞内错综的次级代谢调控网络。大量微生物全基因组序列的测定和功能基因组学技术的涌现，能够从整体上认识微生物代谢网络；从基因、RNA、蛋白质、代谢物、代谢通量等多个层次系统地分析微生物代谢，极大地推动了代谢工程和微生物发酵工业的发展。代谢工程的发展主要体现在高通量组学分析技术的产生，基因组水平代谢网络模型的建立。代谢工程技术目前已经发展到可以从全局的角度分析改造细胞、设计合成新的生物元件，并且能够改造已经存在的生物系统。
二、代谢工程设计策略
代谢工程的主要目标是识别特定的遗传操作和环境条件的控制，以增强生物技术过程的产率及生产能力，或对细胞性质进行总体改造。在代谢工程发展的初期，代谢工程首先从分析细胞代谢网络结构着手，依据已知的生化反应找到代谢过程中的节点；然后采取合适的分子改造方法进行遗传改造，从而调整细胞的代谢网络；最后对改造后的细胞生理、代谢等状态进行综合分析，确定后续代谢工程的相关工作。
经典的系统代谢工程的策略有以下3个步骤：
1、构建起始工程菌。分析了局部代谢网络结构后，对其代谢途径进行改造，优化细胞生理性能等。
2、基因组水平系统分析和计算机模拟代谢分析。通过高通量组学分析技术的使用

，可以将能提高细胞发酵性能的基因和代谢途径有效地鉴定出来。基因组水平代谢网络模型的构建，也可以模拟分析出另外一些靶点基因。
3、对工业水平发酵过程进行优化，使目的产物代谢达到较高的工业化生产水平[3]。
三、代谢工程在发酵工业中的应用
随着对微生物代谢网络研究的深入及DNA重组技术的日趋完善，通过基因克隆技术改变微生物代谢途径的某些关键步骤，大大提高了产物产率；通过基因重组技术改变微生物的代谢途径，还生产出传统发酵工业无法获得的新产品。微生物基因组学和代谢组学的快速发展，对代谢工程有极大的推动作用[4]。代谢工程在工业微生物育种领域的应用，主要体现在以现代基因工程技术为优化手段，对微生物进行定向的改造，集中于细胞代谢流的控制，以提高目的代谢物的产量或产率。根据微生物的不同代谢特性，代谢工程的应用主要表现在以下三个方面：
1、扩展代谢途径
在宿主细胞中引入外源基因，使原来的代谢途径向后延伸，产生新的末端代谢产物，或是使代谢途径向前延伸，能利用新的原料合成代谢产物，提高产量。张勤等[5]从自然样品中筛选分离得到一株能在pH 2.5的培养基中生长且不利用乳酸的酵母菌，将外源的乳酸脱氢酶编码基因ldhA插入含有G418抗性基因的酵母穿梭载体，构建重组质粒，导入后筛选获得一株具有产L-乳酸能力的重组菌株；通过发酵实验表明，该重组菌产L-乳酸的最适pH为3.5，并在pH 2.5时能正常发酵产乳酸。从自然界筛选的耐高浓乳酸的耐酸酵母菌，并以此为宿主菌构建了具有生产L-乳酸能力的耐酸重组酵母，成功地为以耐酸酵母菌高产L-乳酸进行探索。该耐酸酵母菌株不能利用乳酸，采用代谢工程技术，在耐酸酵母中表达乳酸脱氢酶基因，使原来的代谢途径向后延伸，增加了乳酸合成代谢途径，代谢葡萄糖生成乳酸。
2、重新分配代谢流
如果要利用微生物细胞内的脂肪酸以及脂肪酸代谢中间产物生产生物柴油，中断其β-氧化降解途径是必要的。在大肠杆菌中，编码β-氧化降解途径第一步的脂酰辅酶A合成酶的基因被称为fadD。敲除fadD，脂肪酸的产量能大大提高。此外，敲除编码β-

氧化降解途径第二步的脂酰辅酶A脱氢酶的基因fadE，对脂肪酸的合成也有很大的影。因此，可以通过抑制β-氧化降解途径以达到积累脂肪酸的目的[6]。以上的例子说明了在代谢工程中，改变代谢途径即改变分支代谢途径的流向，阻断其他代谢产物的合成，可以达到提高目标产物的目的。在工业微生物育种过程中，改变代谢途径可采用下列不同的方法：
1）加速限速反应，将编码限速酶的基因通过基因扩增。对青霉素生物合成的代谢控制分析表明，代谢流量的控制主要发生在δ- （L-α-氨基己二酰）-L-半肤氨酰-D-缬氨酸合成酶（ACVS）和异青霉素N合成酶（IPNS）两个酶上。要想提高青霉素合成途径的代谢流量，必须在发酵的前期增加ACVS的活性，而在发酵后期要增加IPNS的活性。而且用代谢工程技术同时增加编码ACVS和NS的基因剂量及表达水平，比起单一基因扩增来说、有可能取得更好的效果[7]。Lum等[8]分析泰乐菌素高产菌株的基因组表达情况发现编码酰基辅酶A脱氢酶的aco基因和编码异丁酰辅酶A变位酶的icmA基因的转录水平较野生型菌株有很大提高，增加这两个基因的拷贝数能为泰乐菌素的生产提供更多的脂肪酸前体，这种方法相当于补加前提类似物。无论是增大限速酶基因的拷贝数还是增加其表达活性，都能通过加速限速加大整个代谢流的反应速度，提高目的代谢物的产量或产率。
2）通过改变分支代谢途径的流向，提高代谢分支点的某一代谢途径酶系的活性。在色氨酸的生物合成途径中存在3-脱氢莽草酸（DHS）、莽草酸（SHIK）等一系列具有重要工业价值的中间产物。对于DHS、SHIK的生物合成，主要是通过中心代谢途径改造，增加前体物磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和赤藓糖-4-磷酸（E4P）的供应，以及阻断芳香族氨基酸共有途径中目标产物之后的反应而实现的[9]。通过提高PEP和EP4这两条中酶活性，控制分支代谢途径的流向，提高了目的代谢中间产物的产量。
3）构建代谢旁路。在酵母发酵产生乙醇的过程中最大的副产物就是甘油。甘油产生的主要原因是在厌氧条件下，呼吸链不能起作用，这样使NADH还原成NAD+的唯一途径就是形成甘油醇，来维持细胞内氧化还原电势的平衡。通过转移代谢途径，在氨基酸合成过程中改变辅助因子的需求，可以降低甘油形成。在野生型的菌株中存在由GDH1编码的NADPH依赖型的谷氨酸脱氢酶催化完成的反应；而在酒酵母中存在另外两种分别由GDH2和GDH3编码的依赖NADH的谷氨酸脱氢酶催化完成的反应，同时在酿酒酵母中存在另外一种合成谷氨酸的系统，由GLT1编码的谷氨酸合酶和GLN1

编码的谷氨酰氨合酶催化。赵志军等[10]构建了一株敲除掉GDH1，但是过量表达GDH2或GLT1和GLN1的菌株TN19，结果乙醇的产率提高了10 %，甘油的产率降低了38%。在整个过程中，以强化铵盐的代谢流来达到提高乙醇产量的目的。
4）改变能量代谢途径。Li等[11]敲除了枯草芽孢杆菌的呼吸链中的cyd基因，其产能相对较低，从而降低了维持能，提高了能量途径中的合成效率和磷酸戊糖途径（PP）的通量，很大程度上调节了糖酵解途径以及TCA循环相关代谢途径的链式反应，降低了能量的消耗，核黄素的生物合成的能力得到了有效提高。
3、转移或构建新的代谢途径
乙醇的生产是由传统的发酵工业发展而来的，传统的乙醇生产采用的菌种为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），由于乙醇对酵母细胞的毒性、酵母对底物利用的局限性以及大量副产物的生成等原因使得乙醇的产率不高，生产效率低下。罗进贤等[12]克隆了黑曲霉糖化酶基因和α -淀粉酶基因，并用这两种基因共同和分别转化酿酒酵母，获得多株含双基因和单基因的酵母工程菌。随后，他们将黑曲霉糖化酶GAI cDNA用PCR技术改造以后，重新引人酿酒酵母，在相同的调控元件的调节下获得了较高的表达。改造后的糖化酶基因在酵母中的表达、分泌水平及水解淀粉的能力都高于未改造的基因。酿酒酵母由于缺少水解淀粉所需的酶类，不能直接利用淀粉作底发酵生产乙醇，通过构建新的淀粉代谢途径，突破了酵母对底物利用的局限性。
利用代谢工程技术可以通过构建新的代谢途径，提高工业微生物对胁迫的抗性。乳酸乳球菌是原核细菌中一种重要的工业微生物，其生长依靠发酵产能，不需要氧的参与，但乳酸乳球菌缺乏高效的抗氧胁迫系统，工业生产要求乳酸乳球菌提高对氧的耐受性。乳酸乳球菌的抗氧胁迫系统中没有过氧化氢酶（Catalase, CAT），但存在超氧化物歧化酶 （Superoxide dismutase, SOD）。SOD在清除超氧阴离子自由基时会产生H2O2。而CAT可以使细胞免于遭受H2O2的毒害，是细胞内H2O2代谢的关键酶。因此，将编码CAT的外源基因导入乳酸乳球菌就可以构建乳酸乳球菌的抗氧胁迫突变株 [13]。通过构建新的代谢途径合成CAT，可以有效地提高乳酸乳球菌抵抗氧胁迫的能力。Rochat等[14]在枯草芽胞杆菌中克隆出编码过氧化氢酶的基因KatE，然后将其插入到乳酸乳球菌NZ9000的nisin启动子和信号肽SPUsp45上，产生了有活性的KatE，通过构建新的代谢途径合成

了CAT。
总之，代谢工程在工业微生物育种中的应用体现在：将催化某生物反应的酶基因，克隆到新的微生物中；利用基因工程手段，克隆或改变少数基因，改变代谢网络。枯草芽孢杆菌发酵生产核黄素，通过中心代谢途径的育种思路主要包括以下几个方面[15]：增强菌体对碳源的利用效率；解除核黄素生物合成过程中的反馈调节；切断核黄素生物合成途径的其它代谢支路；增加前体物的供给和利用；增加核黄素操纵子的剂量或增强其表达；增加核黄素生物合成中关键基因的表达；抑制溢流代谢；能量途径的改造。从代谢工程技术入手，工业微生物的育种思路是以网络的形式多方面考虑的，目的是对微生物进行定向改造代谢流的，获得更多的目的代谢物。随着发酵工业的发展，代谢工程的研究也开始向新物质、新途径方向转移。Metabolix 公司成功开发了聚羟基烷酸(poly 3-hydroxyalkanoates, PHA)代谢工程生产菌[16]，能被用来生产可降解塑料。此外，代谢工程还可应用到高等生物中，如基因治疗中。
展望
代谢工程应用前景十分广阔，随着分子生物学、细胞生物学、生理学等生物基础，以及化学工程、数学理论及分析检测和信息技术等外源学科的发展，新的分子生物学技术、蛋白质组学、代谢组学、基因组学等组学技术及高通量分析技术的发展，特别是系统生物学的深入研究及越来越多的生物基因序列的公布，必将大大推动代谢工程的前行。特别是基因识别、基因扩增、基因分离及基因功能分析技术的逐步发展，使代谢工程有目的、有理性的改造更加可行和应用自如。
突变育种随机性大，在提高了抗生素产量的同时也伴随着有害突变的产生，原生质体融合技术只局限于两个菌种之间的融合，没有扩展到两个以上的菌体的融合。以基因工程为基础的代谢工程研究了各种抗生素产生菌的代谢途径，为定向改造菌株提供富的理论基础和实践指导。随着对各种生物产品的合成途径及其相关基因的分子生物学研究的深人，代谢工程为传统产业的改造和生物高技术的发展带来了前所未有的机遇，已经成为国际生命科学技术研究的最重要的热点之一。未来的代谢工程设计除了重构代谢网络，还应当在认识微生物代谢调控机理的基础上，重构基因的表达调控网络，让代谢工程成为投资最少、收益最大的生物技术手段。代谢工程的大力发展，对于全面提升传统产业的技术水平和促进新兴生物技术产业的发展具有重大意义，将会

为解决环境、粮食和能源等当今世界面临的重大问题提供解决思路。

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Application of Metabolic Engineering in Strain Breeding Industrial Microbe
CHEN Qing
Abstract: Traditional strain breeding is still the most commonly used in industrial fermentation strain breeding technology, as the development of gene engineering technology and a plurality of breeding methods, the operation of metabolic pathways introducing a new concept and method, make to the development of metabolic engineering. Metabolic engineering of cell metabolic network of metabolic flux and metabolic control were quantitatively, system analysis, and through the DNA reorganization technology and related genetic means of metabolic transformation, increase of the objective product metabolism. This paper discusses the microbial metabolic engineering theory and its application in fermentation industry in current situation.
Keywords: Metabolic engineering; Strain breeding; Microbial fermentation

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