金黄汤剂对大肠杆菌致小鼠发病治疗作用研究.pdf
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1、2023年 第8期收稿日期院 2023-03-22基金项目院 青岛市科技惠民示范引导专项(21-1-4-ny-10-nsh)袁 山东省牛产业技术体系 渊SDAIT-09-11冤遥作者简介院 李斌 渊1989要冤袁 男袁 山东青岛人袁 硕士袁 兽医师袁 研究方向为动物疫病检测和中兽药药物临床试验遥*通信作者院 张启迪 渊1975要冤袁 男袁 山东威海人袁 教授袁 研究方向为兽医药理学与毒理学袁 E-mail院 遥金黄汤剂对大肠杆菌致小鼠发病治疗作用研究李斌1,3袁 张慧2袁 于鹏1袁 邹明3袁 梁晓3袁 张启迪3*渊1.青岛大沽河流域国家农业科技园发展服务中心袁 山东青岛 266225曰 2.山
2、东畜牧兽医职业学院袁 山东潍坊 261061曰3.青岛农业大学动物医学院袁 山东青岛 266109冤摘要院 为探究金黄汤剂对大肠杆菌引起小鼠发病的治疗效果袁 取 60 只小鼠均等分 6 组袁 每组雌雄各半袁 分别腹腔注射不同剂量的大肠杆菌菌液和灭菌生理盐水袁 确定正式攻毒剂量遥 另取小鼠 120 只随机均分成 6 组袁 每组雌雄各半袁 设置金黄汤剂高 渊0.8mL冤尧 中 渊0.4mL冤尧 低剂量 渊0.2mL冤 组尧 20%氟苯尼考组尧 攻毒组和空白组遥 除空白组外袁 每组小鼠均腹腔注射 0.2mL 大肠杆菌菌液袁 24h 内给药 2 次袁 每次间隔 12h袁 连用 7d遥 经试验袁 最终确
3、定0.2mL 2.16伊108CFU/mL 菌液作为正式试验攻毒剂量遥 药效学试验结果表明袁 金黄汤剂低剂量 渊0.2mL冤 组与高渊0.8mL冤尧 中剂量组 渊0.4mL冤 和 20%氟苯尼考组相比差异显著 渊 约0.05冤袁 金黄汤剂高剂量组 渊0.8mL冤尧 中剂量组(0.4mL)与 20%氟苯尼考组相比差异不显著 渊 跃0.05冤遥 因此袁 在小鼠体重 20g 条件下袁 金黄汤剂按照 0.4mL 的给药剂量袁 对大肠杆菌引起的小鼠发病具有一定的治疗作用遥关键词院 金黄汤剂曰 大肠杆菌曰 小鼠大肠杆菌是畜禽机体肠道内最为常见的细菌袁 只有10%15%大肠杆菌存在致病性遥 大肠杆菌抗原结构
4、复杂袁 其鞭毛尧 荚膜尧 菌毛等都是菌体的主要抗原结构袁 也构成了大肠杆菌多种血清型遥 目前已确定的菌体抗原对猪尧 家禽能产生致病作用的大肠杆菌血清型以O1尧O2尧O35和O78最为常见1遥 近年来随着畜禽集约化养殖模式的飞速发展袁 猪尧 家禽大肠杆菌病的发病率也呈一定的上升趋势袁 且该病发病率多为11%69%袁 死亡率为3.8%72.9%袁 致死率为40.2%90.3%2遥另外袁 无公害和健康养殖的发展趋势又使养殖企业 渊户冤 无法大规模使用抗生素袁 无疑对大肠杆菌病的防治提出了更高的要求遥中药以其毒副作用小袁 安全性高和不易产生耐药性等特点袁 近年来在畜禽减抗尧 替抗的道路上愈发受到重视遥
5、 本试验所采用的金黄汤剂袁 是针对猪尧 家禽大肠杆菌病的临床特性袁 以黄连为主药袁 添以金银花尧 甘草等7种中草药按照一定的比例研制而出遥 为探明此药的临床治疗效果袁本文通过建立大肠杆菌病小鼠模型进行金黄汤剂不同剂量的给药治疗袁 观察小鼠治疗前后的采食量尧 治愈率和死亡率袁 为后期畜禽健康养殖中临床用药提供理论支撑遥1材料1.1试验菌株尧 培养基尧 动物及试验药品大肠杆菌O78在-20环境下保存遥营养琼脂 渊202028冤尧 麦康凯琼脂 渊批号院疫病防控1452023年 第8期201929冤尧LB肉汤培养基 渊202012冤 均购自北京陆桥技术有限公司遥昆明系小鼠 渊180只袁 体重1822g
6、袁 雌雄各半冤 购自辽宁长生生物技术股份有限公司袁 实验动物生产许可证号院SCXK渊辽冤2020-0001遥黄 连 渊202111冤 尧 苦 参 渊202201冤 尧 黄 柏渊202201冤尧 甘草 渊202203冤 均购自安徽广印堂制药有限公司遥 金银花 渊202112冤 购自亳州仁益中药材销售有限公司遥1.2试验仪器本试验使用的实验仪器如表1所示遥2方法2.1金黄汤剂的制备称取金银花和黄连等中药共100g袁 加入10倍量蒸馏水袁 浸泡30min后袁 水煮1h袁 用4层纱布过滤药液后再加入10倍量蒸馏水袁 浸泡45min袁 水煮时间为45min袁 煎煮3次遥 合并三次所得药液袁 温火浓缩至1
7、g/mL遥 将所得药液放于4冰箱中过夜后袁 在6000r/min下离心10min袁取上清液袁 灭菌密封备用遥2.2试验前准备2.2.1试验动物饲养小鼠购进后袁 饲养于小鼠专用实验房内袁 室温2224袁 湿度为50%70%袁 照明/黑暗12h交替进行袁 正常饲养35d遥 饲养笼具使用前用新吉尔灭浸泡消毒遥 雌雄小鼠分笼饲养袁 每个笼具配有水壶和不锈钢网罩袁 自由采食尧 饮水遥 饲喂小鼠全价固体饲料袁 饲料中不添加任何抗生素或抗菌药物遥2.2.2大肠杆菌菌悬液的制备将于-20保存下的大肠杆菌O78复苏后在LB肉汤中增殖遥 采用十倍稀释法袁 用1mL无菌吸管吸取3.6mL LB肉汤于各 试管中袁 吸
8、取0.4mL菌液于第一支试管中吹打混匀袁 后吸取0.4mL于第二支试管中袁 依次稀释至第12支试管遥 分别吸取1mL 10-5尧10-6尧10-7尧10-8尧10-9尧10-10尧10-11和10-12共8个稀释度菌液与3040的营养琼脂混合加入培养皿中 渊每组设置3个重复冤袁 待营养琼脂凝固后放入37环境中培养1214h至长出菌落遥 根据 叶中华人民共和国食品安全国家标准曳渊GB4789.3-2010冤 中规定3袁选取菌落数在30300个的平板袁 进行菌落计数袁 根据计数结果除以涂布体积后乘以稀释倍数为该菌液的浓度遥2.2.3小鼠大肠杆菌病模型的建立取60只小鼠均等分成6组袁 每组小鼠雌雄各
9、半袁 分别腹腔注射0.1尧0.2尧0.3尧0.4和0.5mL大肠杆菌菌液和0.5mL灭菌生理盐水遥 观察小鼠精神状态尧 反应能力和采食引水等状态遥 记录各组小鼠发病时间袁 临床症状尧 死亡情况和器官病理变化等遥 将死亡的小鼠剖检袁 进行大肠杆菌分离鉴定袁 确定是因大肠杆菌所引起的发病死亡袁同时确定正式攻毒剂量遥2.3金黄汤剂小鼠药效学试验试验于2022年5月在山东畜牧兽医职业学院药理实验室内进行遥 取小鼠120只袁 体重(20依1)g袁 随机分成6组袁 每组雌雄各半袁 即金黄汤剂高尧 中尧 低剂量组尧20%氟苯尼考组尧 攻毒组和空白组遥 除空白组外袁 每组小鼠均腹腔注射0.2mL大肠杆菌菌液遥
10、 待小鼠出现精神萎靡袁 不愿采食等临床现象后袁 各试验组按照表2所示进行分组给药袁24h内给药2次袁 每次间隔12h袁电子调温万用电炉 龙口市先科仪器厂 奥豪斯电子秤 上海婉源电子科技有限公司 紫外可见分光光度仪(UV-2550)苏州普今生物科技有限公司 电热压力蒸汽灭菌锅(ZDX-35BI 型)上海申安医疗器械厂 光学显微镜(CX21 型)日本 OLYMPOS 公司 电热恒温培养箱(DHP-9272)深圳三莉科技有限公司 表 1本试验使用的试验仪器及其生产商疫病防控1462023年 第8期图 1各组小鼠死亡时间及只数连用7d袁 用药期间记录各组小鼠采食量袁 死亡数等袁 同时计算各组动物的治愈
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