金果胃康胶囊调控胃癌前病变大鼠HSP27及MAD2表达研究.pdf

陕 西 中 医 药 大 学 学 报 年 月第 卷第 期 .实验研究 引用:惠建萍张耀之刘海涛等.金果胃康胶囊调控胃癌前病变大鼠 及 表达研究.陕西中医药大学学报():.金果胃康胶囊调控胃癌前病变大鼠 及 表达研究惠建萍 张耀之 刘海涛 王军 李龙梅 沈舒文(.陕西中医药大学陕西 咸阳.济源市第二人民医院河南 济源.陕西中医药大学附属医院陕西 咸阳)摘 要:目的 观察金果胃康胶囊对胃癌前病变大鼠胃黏膜、蛋白表达的影响 方法 将 只大鼠随机分为空白组 只和造模组 只 空白组给予正常饮食造模组采用 甲基硝基亚硝基胍()联合乙醇、氨水及饥饱失常组成复合造模法 将造模后大鼠随机分成模型组、金果胃康胶囊高、中、低剂量组和维酶素组 各给药组分别给予相应药物灌胃空白组和模型组给予等量生理盐水灌胃 次连续 后处死所有大鼠取胃体组织光镜下观察各组大鼠胃黏膜组织病理变化免疫组化法检测胃黏膜组织中、蛋白表达情况 结果 模型组大鼠、蛋白表达水平明显高于空白组(均 )各给药组、蛋白表达水平明显低于模型组(均.)且金果胃康胶囊中高剂量组明显低于维霉素组(均.)结论 金果胃康胶囊可逆转胃癌前病变的发生作用机制可能与其能抑制 蛋白的表达及控制 蛋白的表达有关关键词:金果胃康胶囊胃癌前病变慢性萎缩性胃炎中图分类号:.文献标识码:文章编号:():./.(.):.()基金项目:陕西省自然科学基金项目()陕西省中医药管理局项目()国家级沈舒文名中医工作室建设项目作者简介:惠建萍主任医师副教授研究方向:胃肠疾病中医诊治:.通讯作者:李龙梅主管护理师:.年 月第 卷第 期陕 西 中 医 药 大 学 学 报.(.).(.)(.).:胃癌()是全球最常见的四种恶性肿瘤之一每年全世界约有 万人被诊断为 其中约.万人死亡晚期胃癌的中位存活率不到 个月至今仍成为威胁人类健康的一大问题 在我国胃癌患者 年生存率为 其高发病率、低生存率、预后较差严重威胁人类身心健康、生命安全 胃癌的发生常经历多年的胃癌前病变()胃癌前病变是胃癌的“黄金转折点”早期防治胃癌关键是如何正确应对胃癌前病变以及胃癌前状态 胃癌前病变()是指胃部易发生癌变的病理组织学改变包括肠上皮化生()和异型增生()或上皮内瘤变()关于胃癌的形成已被广泛接受的是 模式:正常胃黏膜慢性浅表性胃炎慢性萎缩性胃炎肠上皮化生异型增生胃癌 轻、中度 及肠化可进展为重度异型增生或重度肠化甚至癌变也可逆转一项研究显示上皮内瘤变消退占.、病变稳定占.、病变进展占.具有有一定的癌变潜能 到目前为止胃癌的确切病因及发病机制还不完全清楚因此实施一级预防几无可能 因此慢性萎缩性胃炎肠上皮化生和异型增生是阻击胃癌发生的重要战场所以如何阻断 是胃癌二级预防的重要手段之一 及早识别和控制胃癌前病变向胃癌发展是防治胃癌的重要途径 在我国中医药治疗 可在很大程度上逆转 和 在防治 方面已初步彰显其显著的优越性和广阔的发展前景 本实验旨在对 大鼠组织 与 的表达进行研究揭示金果胃康胶囊治疗 的作用机理 仪器与材料.仪器 生物组织自动脱水机(湖北泰维公司)轮转式石蜡切片机(德国 公司)电热式恒温培养箱(日本)图像采集显微镜(德国 公司).试药 金果胃康胶囊由陕西中医药大学附属医院制剂中心制成含半枝莲、枸橘、朱砂七、太子参等药每粒相当于原生药.维酶素片由新乡恒久远药业有限公司提供批号:甲基硝基亚硝基胍()由东京化成工业株式会社生 产 批 号:兔 抗 大 鼠 多 克 隆 抗体(批号:)兔抗大鼠多克隆 抗体(批号:)北京博奥森生物技术有限公司兔 免疫组化试剂盒(即用型)(批号:)显色试剂盒(批号:)柠檬酸盐冲液 磷酸盐缓冲液湖北省武汉市博士德生物技术公司苏木素染液(批号:)伊红染液(批号:)北京索莱宝科技有限公司.实验动物 健康雄性 级 大鼠 只体重 室温为 相对温度 动物合格证编号:(陕)由西安交通大学医学部实验动物中心提供 方法.实验动物分组及 模型复制参照文陕 西 中 医 药 大 学 学 报 年 月第 卷第 期 .献形成具体造模方案:大鼠购回适应性饲养 周后 只大鼠按随机数字表法随机取分 组:空白对照组 只和造模组 只 除空白对照组每天自由饮水外造模组予以:自由饮用 同时下午灌胃 溶液每只灌液 造模期间采取饥饿无常(每进食 再禁食 进食日自由食用禁食日停 自由饮用.氨水并在禁食当天下午 乙醇按每只 灌胃 灌胃前后禁食禁水 每周用钳子夹住大鼠尾部 次 使 之 保 持 激 怒、争 夺 状 态 持 续 持续 上述各组均以混合饲料喂养 并于造模结束前随机抽取造模组大鼠 只进行胃黏膜病理形态学检查其中 只在光镜下出现肠上皮化生和异型增生为造模成功造模结束后将造模组剩余 只再次按随机数字表法随机分为 组每组 只大鼠分别为模型对照组、金果胃康胶囊大、中、小剂量组维酶素组 加上空白对照组 只大鼠.动物给药方法除空白对照组 只大鼠每天自由饮水外模型组给予 生理盐水其余 组根据人和动物间按体表面积折算的等效计量比值表得出大鼠给药的等效剂量(等效剂量成人 剂量.)给予相应的药物灌胃治疗维酶素组给予维酶素混悬液 灌胃(含维酶素.)金果胃康大中小剂量组每日灌胃(各含生药.、.、.)每天上午灌胃 次连续 .标本收集及处理 处死大鼠前将禁食禁水 后腹部注射水合氯醛(约)剖腹取胃沿胃大弯剪开蒸馏水清洗后然后剪取胃体部一块组织将其置于 多聚甲醛溶液中固定 后组织常规脱水石蜡包埋切片 染色光镜下观察胃黏膜病理变化及免疫组化染色.、免疫组化染色步骤 免疫组织化学采用常规 法操作步骤按试剂盒说明书进行 用已知阳性切片(由试剂公司提供)做阳性对照用 液代替一抗作阴性对照.结果判定.病理诊断评定标准及病理分级标准参照 年上海全国第二届慢性胃炎共识会议通过的中国慢性胃炎共识意见进行诊断及分类.免疫组织化学光学显微镜下以细胞质或细胞膜出现棕黄色或棕黑色颗粒为阳性细胞 每张切片任意选择 个 倍视野采用 图像分析软件进行分析处理测量每个视野光度值计算平均光密度.统计学方法采用 .统计软件包建立数据库计量资料将采用均数标准差表示各组间的差异比较采用单因素方差分析取双侧.为显著性检验水准 结果.一般情况观察 大鼠共 只分空白组 只和造模组 只造模结束后抽取造模组 只老鼠验证造模是否成功剩余 只大鼠药物干预期间模型组、维酶素组各死亡 只金果胃康高、低剂量组各死亡 只故最后剩余 只大鼠进行实验结果分析实验过程中空白组大鼠被毛纯净浓密光泽度好双目灵活反应敏捷喜动进食正常体重逐渐增加大便有形呈颗粒状 其余各组大鼠均有不同程度病态表现:毛色逐渐变黄变暗无光泽精神萎靡双眼无神反应迟缓扎堆不喜活动食量逐渐减少大便不成形形体逐渐消瘦背上弓个别大鼠因营养缺乏机能衰竭而死亡 经治疗后大鼠的一般状态有所好转 各治疗组比正常对照组略差但明显优于模型组 各治疗组较维酶素组状态好以金果胃康中剂量组大鼠状态恢复最好.各组病理组织学观察 光镜下观察空白组胃黏膜结构正常层次清楚、完整腺体排列紧密、规则未见炎细胞浸润模型组胃黏膜呈不同程度的萎缩黏膜层变薄、充血、水肿嗜酸性粒细胞及中性粒细胞浸润腺体排列紊乱部分腺体囊性扩张上皮细胞增生并可见黏膜部分区域出现上皮化生及异型增生细胞核大、深染其他用药组胃黏膜层变薄未见充血及水肿萎缩、肠上皮化生、异型增生程度均有明显减轻和缓解其中金果胃康中剂量组效果最好其次依次是金果胃康大剂量组、维酶素组、金果胃康小剂量组(图)年 月第 卷第 期陕 西 中 医 药 大 学 学 报.空白组.模型组.金果胃康高剂量组.金果胃康中剂量组.金果胃康低剂量组.维酶素组图 各组大鼠胃黏膜组织病理形态学改变().免疫组化结果 染色结果:各组免疫组化染色结果阳性表达为细胞质或细胞核呈棕黄色或褐色.实验结果空白组大鼠胃黏膜可见染色最轻细胞染色数目最少金果胃康中剂量组与其余各组相比大鼠胃黏膜可见染色较轻染色数目较少模型组染色最重模型组细胞染色数目最多(见图)与空白组比较模型组大鼠胃黏膜 表达水平显著上升差异有统计学意义(.)与模型组比较金果胃康胶囊高、中、低剂量组与维酶素组大鼠 表达水平均明显降低差异有统计学意义(.)与金果胃康胶囊中剂量组比较金果胃康胶囊高、低剂量组与维酶素组大鼠 表达水平较高差异有统计学意义(.)(见表).空白组.模型组.金果胃康高剂量组.金果胃康中剂量组.金果胃康低剂量组.维酶素组图 各组大鼠胃黏膜组织 表达(免疫组化染色 法)陕 西 中 医 药 大 学 学 报 年 月第 卷第 期 .表 各组大鼠胃黏膜 检测结果()分组(平均光密度/)空白组.模型组.金果胃康高剂量组.金果胃康中剂量组.金果胃康低剂量组.维酶素组.注:与模型组对比.与金果胃康中剂量组对比.实验结果空白组大鼠胃黏膜可见染色最轻细胞染色数目最少金果胃康中剂量组与其余各组相比大鼠胃黏膜可见染色较轻染色数目较少模型组染色最重模型组细胞染色数目最多(见图)与空白组比较模型组大鼠胃黏膜 表达水平显著上升差异有统计学意义(.)与模型组比较金果胃康胶囊高、中、低剂量组与维酶素组大鼠 表达水平均明显降低差异有统计学意义(.)与金果胃康胶囊中剂量组比较金果胃康胶囊高、低剂量组与维酶素组大鼠 表达水平较高差异有统计学意义(.)(见表)表 各组大鼠胃黏膜 检测结果()分组(平均光密度/)空白组.模型组.金果胃康高剂量组.金果胃康中剂量组.金果胃康低剂量组.维酶素组.注:与模型组对比.与金果胃康中剂量组对比.空白组.模型组.金果胃康高剂量组.金果胃康中剂量组.金果胃康低剂量组.维酶素组图 各组大鼠胃黏膜组织 表达(免疫组化染色 法)讨论中医学将 归为“胃痞”“胃脘痛”等病证范畴 一般以 常出现的胃脘胀满、疼痛、烧心、嘈杂、口苦、纳差等症状为主要表现又因人、因病理阶段而异而临床表现不同 沈舒文认为 病变过程中具有因邪致虚因虚致邪的转化特点其邪实是导致其虚乃至损伤胃黏膜致肠上皮化生的直接病理因素邪实的病理特征是湿热久藴为毒因毒致瘀毒瘀交阻 毒瘀交阻是发生 的病机关键故治疗本病不论病程中正邪如何变化始终抓住毒与瘀这个根本性病理治疗扶正兼治毒瘀祛邪更需围绕毒瘀予以解毒化瘀 年 月第 卷第 期陕 西 中 医 药 大 学 学 报.金果胃康胶囊是国家级名中医建设项目沈舒文教授以解毒化瘀行气散结为治疗原则的胃癌前病变经验方 本方由半枝莲、朱砂七、枸橘、太子参四味药组成 君药半枝莲具清热解毒活血化瘀作用针对主要病机清解滋胃毒邪消散胃络凝瘀 半枝莲抗肿瘤已经成为现代研究的主要方向半枝莲抗肿瘤的主要成分为黄酮类以及多糖类黄酮类主要作用可以改善肿瘤生长的微环境抑制肿瘤转移扩散 张锋等通过研究证实 可抑制胃癌细胞增殖诱导细胞凋亡并提高其放疗敏感性 半枝莲多糖具有多种药理活性可作为一种免疫调节剂激活免疫系统具有增强机体免疫力、延缓衰老和抑制肿瘤等功效抗肿瘤作用主要通过抑制肿瘤细胞增殖抑制肿瘤细胞血管的生成与转移调节免疫以及诱导肿瘤细胞的凋亡等多种途径共同实现臣药朱砂七为治疗胃癌的太白七药之一其功效之一清热解毒增强君药的解毒作用其二活血凉血散瘀止痛助君药消散胃络凝瘀且增强本方的止胃痛作用 现代药理研究朱砂七可影响肿瘤细胞的糖代谢诱导肿瘤细胞凋亡从而发挥抗肿瘤的作用防止肿瘤发展 佐药枸橘是具有抗癌作用的理气草药具有行气散结功效全国中草药汇编记载本品具有“健胃消食行气止痛”作用现代药理研究枸橘具有抗菌、抗炎、抗肿瘤、促进肿瘤细胞凋亡研究表明枸橘主要成分枸橘苷激活外源性凋亡通路抑制肿瘤细胞增长促进肿瘤细胞凋亡 又因 的发生多以气阴两虚为发病基础即毒瘀交阻多发生在气阴两虚的基础上故佐以太子参益气养阴补益脾胃现代药理研究表明太子参主要成分太子参环肽具有抗疲劳、增强免疫、抗菌、抗氧化、抗病毒等作用可抑制肿瘤发生、发展 四味药物合用共奏解毒化瘀行气散结之功针对毒瘀交阻胃气郁结毒瘀并治行气散结可消除因毒瘀交阻滞胃碍气的症状恢复胃主和降的功能 在前期临床试验中发现在金果胃康胶囊基础上确立组方用药的治疗组有效率.对照组有效率 治疗组疗效优于对照组其差异有统计学意义(.)近年来越来越多的研究发现热休克蛋白在胃癌中过度表达参与肿瘤的发生、发展、分化及预后等方面 热休克蛋白()又称应激蛋白是指生物细胞在生理应激或病理状态以及各种环境因素的刺激下使基因被激活细胞内诱导合成的且高效表达的一组进化上高度保守的胞质蛋白质 通过促进新合成蛋白质的准确折叠和变性蛋白质的重折叠来参与蛋白质质量控制()是小分子 亚家族中重要的一员参与了细胞的增殖、分化以及细胞凋亡的信号转导调节与肿瘤关系密切目前研究证实 与胃癌的发生关系密切在胃癌的表达、形成、增殖、复发、转移及肿瘤免疫中具有非常重要的作用 研究显示 在胃癌中的表达率为 而在慢性非萎缩性胃炎和慢性萎缩性胃炎中的表达率分别为 和 的高水平也与胃癌和结直肠癌的进展期、不良生存率和预后有关 研究表明高水平的血清 可能是评估胃癌的有用标记物现代细胞遗传学和分子生物学研究表明染色体不稳定性()是所有癌前细胞和癌细胞的本质特征是肿瘤发生发展和异质性的发动机 是指癌细胞较之于正常细胞出现的染色体数目及结构异常 绝大多数肿瘤表现为 细胞周期检查点紊乱、染色体分离、损伤反应及端粒功能的缺陷或丧失等多种细胞功能障碍都可导致发生 染色体正确分离过程中有一个由检查点蛋白()组成的监控体系能准确地识别纺锤体微管与染色体动粒的连接从而保证染色体的正常分离 有丝分裂阻滞缺陷蛋白 ()是的关键成分之一可以通过磷酸化和去磷酸化来调节其蛋白的活性起到调节纺锤体微管与染色体动粒的连接的作用 功能改变可引起纺锤体检查点控制失常导致染色体不稳定性增加染色体缺失的概率升高 其机制可能是:的异常使纺锤体组装检查点的功能出现缺损不能阻滞动粒微管结合异常的肿瘤细胞进行有丝分裂而导致染色体多极化引起非整倍体细胞的形成导致肿瘤的发陕 西 中 医 药 大 学 学 报 年 月第 卷第 期 .生这些异常改变进而又有可能成为肿瘤诊断标记和治疗靶点 王玉发现 在胃癌发病机制中扮演着高表达的癌基因的角色由此可见、在胃癌前病变中呈高表达而在正常组织细胞中不表达或很少表达本研究结果表明在 中、表达较高经金果胃康胶囊治疗后两种蛋白的阳性表达率显著降低其中金果胃康胶囊中剂量效果最显著 两种蛋白表达降低表示金果胃康胶囊可能抑制 的表达和通过控制 稳定染色体的不稳定性从而促进 细胞的凋亡使细胞逐渐恢复正常逆转胃黏膜损伤的各项病理生化指标保护、修复胃黏膜损伤阻断 向胃癌的转变参考文献 .:.():.王雪梅于倩.胃癌患者 年生存情况随访调查及影响因素.中国卫生工程学():.万昱辰刘粉叶.胃癌前病变中医病机与治疗机制研究进展.辽宁中医药大学学报():.杨嘉力何芳王芳等.胃黏膜低级别上皮内瘤变转归及其影响因素研究.宁夏医学杂志():.宋健袁敏惠崔冰慧等.金果胃康胶囊对 大鼠/信号通路的干预研究.陕西中医药大学学报():.宋健袁敏惠刘争辉等.基于“毒瘀交阻”探讨金果胃康胶囊对 大鼠/通路调控的影响.现代中医药():.叶景阳朱西杰王儒等.复方蜥蜴散不同微粒组合剂对胃癌前病变模型大鼠 信号通路下游、蛋白表达的影响.时珍国医国药():.杨宗保王晨光陈娇龙等.艾灸对慢性萎缩性胃炎癌前病变大鼠胃黏膜细胞增殖因子的影响.中国针灸():.惠建萍张耀之王军等.胃癌前病变大鼠动物模型研究进展.现代中医药():.谢晶日王业莉张扬等.复合造模法建立大鼠胃癌前病变模型的实验研究.中华中医药学刊():.惠建萍马小兵沈舒文等.解毒化瘀法治疗毒瘀交阻型胃癌前病变临床研究.陕西中医药大学学报():.刘新杨商亚珍.半枝莲提取黄酮类化合物药理学研究进展.承德医学院学报():.张锋吴震徐宁等.半枝莲总黄酮调控 对人胃腺癌细胞 增殖、凋亡和放疗敏感性的作用及机制研究.药物评价研究():.张洪石苏文文张启明等.半枝莲抗肿瘤生物活性研究进展.中国药物经济学():.李娜王平孙铁锋等.半枝莲化学成分、药理作用及质量控制研究进展.中国中药杂志():.任慧张红崔小敏等.朱砂七化学成分、药理作用及质量控制研究进展.现代中药研究与实践():.():.张韡李忠.枸橘苷对胃癌细胞抑制作用及其机制研究.中国病理生理杂志():.:.():.:.():.文静方念邓欢等.热休克蛋白 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