针药联合对阿尔兹海默病模型大鼠小脑皮质谷氨酸受体2及Caspase-3表达的影响.pdf
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1、本文引文格式:李楠,王梓萌,邵紫祎,等.针药联合对阿尔兹海默病模型大鼠小脑皮质谷氨酸受体2及C a s p a s e-3表达的影响J.右江民族医学院学报,2 0 2 4,4 6(1):7-1 2.【论著与临床报道】针药联合对阿尔兹海默病模型大鼠小脑皮质谷氨酸受体2及C a s p a s e-3表达的影响李楠1,王梓萌1,邵紫祎1,王如雪2,黄锐3,王林3,赵健3(1.皖南医学院临床医学院,安徽 芜湖 2 4 1 0 0 0;2.皖南医学院研究生学院,安徽 芜湖 2 4 1 0 0 0;3.皖南医学院基础医学院,安徽 芜湖 2 4 1 0 0 0)摘 要:目的 观察针药联合对阿尔兹海默病(A
2、 D)模型大鼠小脑皮质谷氨酸受体(G l u R 2)及天冬氨酸蛋白水解酶(C a s p a s e-3)表达的影响,探讨小脑在A D发病机制中的作用。方法 3 0只雄性S D大鼠随机分为5组:对照组(C组)、模型组(M组)、电针组(E A组)、天麻素组(G a s组)、针药联合组(E A+G a s组),每组6只。C组不作任何处理;M组大鼠给予双侧海马内微量注射5L的A1-4 2进行造模;E A组予以频率2H z、强度1 mA的电针刺激,选取穴位“大椎”“百会”“足三里”,每日3 0m i n,连续4周。G a s组予以腹腔注射G a s注射液(1 0m g/k g),每天1次,连续4周;
3、E A+G a s组同时予以电针和G a s治疗,连续4周。M o r r i s水迷宫检测大鼠学习记忆行为能力,N i s s l染色和免疫组化方法观察各组大鼠小脑皮质细胞形态和数量,W e s t e r nB l o t法检测各组G l u R 2和C a s p a s e-3蛋白的表达。结果 M组小脑皮质中浦肯野层细胞数量减少(P0.0 5),G l u R 2表达降低(P0.0 5),C a s p a s e-3表达增高(P0.0 5);各治疗组较M组的细胞形态趋于正常,G l u R 2的表达增加(P0.0 5),C a s p a s e-3的表达降低(P0.0 5),其中以
4、E A+G a s组改变最为明显。结论 电针、天麻素及针药联合均可通过调节G l u R 2和C a s p a s e-3的表达水平进而改善A D模型大鼠学习记忆能力,其中针药联合效果最佳。关键词:阿尔茨海默病;谷氨酸受体2;半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3;电针;天麻素中图分类号:R 7 4 5.7 文献标识码:A 文章编号:1 0 0 1-5 8 1 7(2 0 2 4)0 1-0 0 0 7-0 6d o i:1 0.3 9 6 9/j.i s s n.1 0 0 1-5 8 1 7.2 0 2 4.0 1.0 0 2E f f e c t so f e l e c t r o a c u p
5、 u n c t u r e-g a s t r o d i nc o m b i n e do nt h e e x p r e s s i o n so f g l u t a m a t e r e c e p t o r2a n dC a s p a s e-3i nt h ec e r e b e l l a r c o r t e xo f r a t sw i t hA l z h e i m e rsd i s e a s eL iN a n1,W a n gZ i m e n g1,S h a oZ i y i1,W a n gR u x u e2,H u a n gR u
6、i3,W a n gL i n3,Z h a oJ i a n3(1.S c h o o l o fC l i n i c a lM e d i c i n e,W a n n a nM e d i c a lC o l l e g e,W u h u2 4 1 0 0 0,A n h u i,C h i n a;2.G r a d u a t eS c h o o l,W a n n a nM e d i c a lC o l l e g e,W u h u2 4 1 0 0 0,A n h u i,C h i n a;3.S c h o o l o fB a s i cM e d i c
7、i n e,W a n n a nM e d i c a lC o l l e g e,W u h u2 4 1 0 0 0,A n h u i,C h i n a)A b s t r a c t:O b j e c t i v e T oo b s e r v e t h e e f f e c t so f e l e c t r o a c u p u n c t u r e c o m b i n e dw i t hm e d i c i n eo n t h e e x p r e s-s i o n so fg l u t a m a t er e c e p t o r2(G
8、l u R 2)a n dC a s p a s e-3i nt h ec e r e b e l l a rc o r t e xo f r a t sw i t hA l z h e i m e rsd i s e a s e(A D)a n de x p l o r e t h e r o l eo f c e r e b e l l u mi nt h ep a t h o g e n e s i so fA D.M e t h o d s T h i r t ym a l eS Dr a t sw e r e r a n-d o m l yd i v i d e di n t o5g
9、 r o u p s:c o n t r o lg r o u p(Cg r o u p),m o d e lg r o u p(M g r o u p),e l e c t r o a c u p u n c t u r eg r o u p7第4 6卷 第1期 右江民族医学院学报 V o l.4 6N o.12 0 2 4年2月 J o u r n a l o fY o u j i a n gM e d i c a lU n i v e r s i t yf o rN a t i o n a l i t i e s F e b.2 0 2 4基金项目:国家自然科学基金项目(8 1 9 0
10、1 1 0 5);国家级大学生创新创业训练计划项目(2 0 2 2 1 0 3 6 8 0 6 1);皖南医学院重点科研基金项目(WK 2 0 2 0 Z 1 2)第一作者:李楠,大学生,研究方向:神经退行性病变研究,E-m a i l:1 6 0 1 8 9 5 9 7 3q q.c o m 通讯作者:赵健,副教授,研究方向:神经退行性病变研究,E-m a i l:3 0 9 7 7 8 7 2 1q q.c o m(E Ag r o u p),g a s t r o d i ng r o u p(G a sg r o u p),a n da c u p u n c t u r e-m e
11、d i c a t i o ng r o u p(E A+G a sg r o u p),w i t h6r a t si ne a c hg r o u p.T h eCg r o u pr e c e i v e dn ot r e a t m e n t.T h eMg r o u pw a sm o d e l e db ym i c r o i n j e c t i o no f 5LA1-4 2 i n t ob i l a t e r a lh i p p o c a m p u s.T h eE Ag r o u pr e c e i v e de l e c t r o a
12、 c u p u n c t u r es t i m u l a t i o na taf r e q u e n c yo f2H za n da n i n t e n s i t yo f 1mAa t a c u p o i n t s“D aZ h u i”,“B a i h u i”,a n d“Z uS a nL i”f o r 3 0m i n u t e sd a i l y f o r f o u r c o n-s e c u t i v ew e e k s.T h eG a sg r o u pr e c e i v e di n t r a p e r i t o
13、 n e a l i n j e c t i o no fg a s t r o d i ns o l u t i o n(1 0m g/k g)o n c ead a yf o r f o u rw e e k s.T h eE A+GAg r o u pw a s t r e a t e dw i t hE Aa n dG a s f o r 4c o n s e c u t i v ew e e k s.M o r r i sW a t e rM a z ew a su s e dt o t e s t t h e l e a r n i n ga n dm e m o r yb e h
14、 a v i o ro f r a t s;N i s s l s t a i n i n ga n d i mm u n o h i s t o c h e m i s t r yw e r ep e r-f o r m e dt oo b s e r v e t h em o r p h o l o g ya n dq u a n t i t yo f c e r e b e l l a r c o r t e xc e l l s i ne a c hg r o u p,a n dt h ee x p r e s s i o n so fG l u R 2a n dC a s p a s
15、 e-3p r o t e i n sw e r ed e t e c t e db y W e s t e r nB l o t.R e s u l t s I nt h e M g r o u p,t h en u m b e ro fP u r k i n j ec e l l sd e c r e a s e d i nt h ec e r e b e l l a rc o r t e x(P0.0 5),t h ee x p r e s s i o no fG l u R 2d e c r e a s e d(P0.0 5),a n dC a s p a s e-3 i n c r
16、e a s e d(P0.0 5).T h ec e l lm o r p h o l o g yo f e a c ht r e a t m e n tg r o u pt e n d e dt ob en o r m a l c o m-p a r e dw i t ht h eMg r o u p,w i t h i n c r e a s e dG l u R 2e x p r e s s i o n(P0.0 5)a n dd e c r e a s e dC a s p a s e-3e x p r e s s i o n(P0.0 5).T h eE A+G a sg r o u
17、 ps h o w e dt h em o s t s i g n i f i c a n t c h a n g e s.C o n c l u s i o n T h eE A,g a s t r o d i na n dE A+G a sc a ni m p r o v et h el e a r n i n ga n dm e m o r ya b i l i t yo fA D m o d e lr a t sb yr e g u l a t i n gt h ee x p r e s s i o nl e v e l so fG l u R 2a n dC a s p a s e-
18、3,a n dt h ec o m b i n a t i o no f t w om e t h o d sh a s t h eb e s t e f f i c a c y.K e yw o r d s:A l z h e i m e rsd i s e a s e;g l u t a m a t er e c e p t o r2;a s p a r t a t ep r o t e o l y t i ce n z y m e-3;e l e c t r o a c u p u n c-t u r e;g a s t r o d i n 阿尔茨海默病(A l z h e i m e
19、rsd i s e a s e,A D)是一种以记忆力消退、晚期呈现全方面认知损害为主要特征的神经系统退行性疾病。目前认为A D主要累及海马、杏仁核等与学习记忆密切相关的部位,而小脑因细胞分子水平不受累假说,常仅作为影像学观察的参照对象1,关 于 其 机 制 研 究 资 料 较 少。谷 氨 酸 受 体(G l u R)2是a-氨基-3-羟基-5-甲基-异恶唑丙酸受体(AMP A R)中的一个单独亚基,在多种神经元中高表达,但其在神经性损伤或退行性疾病中的作用仍有争议。近年来,电针(e l e c t r o a c u p u n c t u r e,E A)被广泛应用于众多神经系统疾病治疗,
20、其在A D的临床应用越来越受到重视。研究表明,电针对大鼠的学习和记忆力有显著的提高作用2。天麻素(g a s t r o d i n,G a s)具有抗氧化和保护神经元的功能3。电针联合天麻素在A D治疗中的作用机制目前尚不完全明确,本实验采用电针、天麻素单独治疗及二者联合应用的方法,观察比较G l u R 2和C a s p a s e-3在A D模型大鼠小脑皮层中的表达变化,以探讨其作用机制,为A D发病机制及治疗提供基础研究依据。1 材料和方法1.1 实验动物 3 0只8周龄雄性S D大鼠,体重(2 2 02 0)g,许可证号:S C X K 鲁2 0 1 9-0 0 0 3,山东省实验
21、动物中心提供。经1周适应性饲养后,随机分成对照组(C组)、模型组(M组)、电针组(E A组)、天麻组(G a s组)和针药联合组(E A+G a s组),每组6只。1.2 实验试剂和仪器 G l u R 2和C a s p a s e-3一抗(北京博奥森生物技术有限公司)、A1-4 2(A p e x,美国)和天麻素注射液(西南药业股份有限公司)。M o r r i s水迷宫视频分析系统(北京众实迪创科技发展有限责任公司)、脑立体定位仪(成都泰盟软件有限公司)、S D Z-型华佗牌电子针疗仪(苏州医疗用品厂有限公司)、L e i c a石蜡切片机(L e i c a,德国)、数字荧光切片扫描仪
22、(H a m a m a t s u,日 本)和I m a g e J图 像 分 析 系 统(O-L YMP U S,日本)。1.3 大鼠模型制备及治疗 模型制备:将大鼠固定于脑立体定位仪,保持头部水平位。经前期动物预实验后确认双侧海马位置(以前囟为基准点后移3.8mm,旁开2.5 mm,进针深度4.0 mm),缓慢微量注射A1-4 2,每侧2L,后缝合伤口,碘伏擦拭防止感染。治疗方法:E A组:依据 大鼠穴位图谱的研制,于“百会”“大椎”及双侧“足三里”穴位采用频率2H z、强度1mA、连续波的电针参数进行穴位刺激,每天3 0m i n,持续4周。G a s组:用生理盐水溶液配置天麻素注射液
23、(稀释比例91),1 0m g/k g剂量进行腹腔注射,持续4周。E A+G a s组:同时采用E A和G a s两种疗法,持续4周。1.4 M o r r i s水迷宫实验 将大鼠头部朝向器壁,置于水迷宫中的固定象限,首先将水灌到比平台高12c m的位置,然后向水中添加少量的墨水,直到看不见平台。室内保持安静,事先将空调打开,将房间里的温度调整到2 52 6之间,并用不间断的日光灯进行照射,将水的温度控制在2 6左右。将大鼠放入池壁水中,测试大鼠能否在9 0s内找到平台,能则让其在平台上休息2 0s,并在下一象限重新开始,不能则将大鼠引上平台,休息2 0s,再从下一象限重新开始。第5天撤出平
24、台继续观测记录大鼠的行动轨迹,分别记录大82 0 2 4年 右江民族医学院学报 第1期鼠在4个象限的潜伏期、总行程、到达平台的时间、通过平台次数以及在目标象限逗留时间等数据并导出大鼠的行动路线图。具体行为学数据见本课题组前期研究结果4。1.5 组织取材 在大鼠腹部上方做一切口,切开横膈肌,打开胸腔,将灌注针从左心室插入升主动脉,用2 5 0m L的4生理盐水迅速灌注冲洗,断头后在冰台上取出小脑组织并分成左右两半,左半石蜡包埋后用于N i s s l染色及免疫组化染色,右半低温冷冻保存用于W e s t e r nB l o t实验。1.6 N i s s l染色 石蜡切片脱蜡至水,P B S冲
25、洗,放入焦油紫染色液中5 6 染色6 0m i n(染色需避光),分化液浸泡35s后蒸馏水冲洗,二甲苯透明,中性树脂胶封片。晾干后可在镜下观察小脑皮质浦肯野细胞层细胞形态及数量。1.7 免疫组化染色 石蜡切片脱蜡至水后抗原修复、血清封闭孵育、滴加G l u R 2/C a s p a s e-3进行一抗孵育、二抗孵育、S A B C孵育,最后使用二氨基联苯胺(D A B)显色。镜下确认显色程度后封片,用切片扫描仪扫描后观察阳性细胞形态及数量。同时设立空白对照组,用P B S代替一抗进行孵育,其他步骤不变。1.8 W e s t e r nB o l t 提取小脑组织,分别称取5组约0.0 2
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