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金枪鱼泡吻棘头虫的分离与鉴定.pdf
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1、栏目编辑 宋迁红病 害 防 治2023.8目前国内外罕有报道金枪鱼感染棘头虫。本研究在进口金枪鱼体内发现了大量棘头虫感染,经过形态学观察和分子生物学鉴定,证实该寄生虫为泡吻棘头虫。泡吻棘头虫能够通过吻突刺进鱼肠道黏膜造成机械损伤,容易造成继发感染,同时会消耗营养物质,造成鱼体消瘦,其代谢产物能够扰乱鱼体组织细胞的正常生理功能,导致免疫力下降。一、材料和方法1.主要试剂及仪器福尔马林(38%甲醛溶液)、甘油(丙三醇)均为分析纯,购自南京化学试剂股份有限公司;氯化钠、乙酸、95%乙醇均为分析纯,购自国药集团化学试剂有限公司;MagMAXCORE核酸提取试剂盒购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司;Ta
2、q DNA聚合酶和DL 2000 marker购自宝日医生物技术(北京)有限公司;体视显微镜为蔡司Discovery V8,PCR仪为ABI VERITI。2.金枪鱼临床检查2023年1月,江苏口岸进口冰鲜金枪鱼被送至实验室检测,观察鱼鳃和体表后将内脏取出,依次剖解心、肝、食道、胃、肠进行观察,在肠腔内发现疑似泡吻棘头虫,虫体的泡与颈部已经穿过肠壁,躯体仍在肠道中,将虫体从肠壁剥离,置于加有生理盐水的培养皿中,清除虫体周围杂物。3.虫体形态学观察将虫体透明化后作进一步形态学观察。将初步鉴定的可疑虫体置于热乙醇中,待虫体伸直后用巴氏液(0.85 克氯化钠和3毫升福尔马林溶液溶于蒸馏水97毫升中)
3、固定,再用10%甘油乙醇(10毫升甘油溶于90毫升70%乙醇中)透明处理,在体视显微镜下观察虫体内部形态特征。4.分子生物学鉴定将整个虫体用核酸提取试剂盒提取基因组DNA,以18S和28S rRNA基因为分子标记来鉴定物种种类。18S的引物参考马振华等(2011),5R:5-CTTGGCAAATGCTTTCGC-3和 1F:5-TACCTGGTTGATCCTGCCAGTAG-3;8R:5-ACGGGCGGTGTGTAC-3 和 3F:5-GTTCGATTCCGGAGAGGGA-3;9R:5-GATCCTTCCGCAGGTTCACCTAC-3和A2.0:5-ATGGTTGCAAAGCTGAAAC
4、-3。28S 的引物 F:5-ACCCSCTGAAYTTAAGCA-3,R:5-AACTCTCTCMTTCARAGTTC-3。50微升PCR反应体系:10PCR缓冲液5.0微升、氯化镁5.0微升、dNTPs 2.0微升、正向引物和反向引物各 1.0 微升、耐热 DNA 聚合酶0.5微升、DNA模板2.5微升,加灭菌去离子水至总体积 50 微升。PCR 反应条件:94、3 分钟;94、30 秒;48、30 秒;72、2 分钟,共30个循环;72、5分钟。扩增产物由上海生工生物 工 程 有 限 公 司 测 序。将 测 序 结 果 在 NCBIGenBank 数据库中比对,用 MEGA 11 构建系
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