对比教学法在大型仪器实验教学中的应用——以番茄汁中克百威的检测为例.pdf

2024，Vol.27，No.1饮 料 工 业教学实践摘要：以番茄汁中克百威的检测为例，将对比教学法应用于高效液相色谱仪（HPLC）和液相色谱-质谱联用仪（HPLC-MS）的实验教学中。在理论教学部分，对比两种大型仪器的原理、构造、应用特点及其在克百威检测中的异同。在上机实操部分，由于番茄汁中的克百威含量低于 HPLC 法的检出限但高于 HPLC-MS 法的检出限，两种仪器得出截然不同的检测结果。对比教学法切实提高了实验教学效率，提升了学生的大型仪器综合运用能力，对高校应用型人才的高质量培养具有重要意义。关键词：对比教学法；大型仪器；实验教学；克百威Application of Comparative Teaching Method in Experimental Teaching of Large-scale Instruments-Takethe Determination of Carbofuran in Tomato Juice as an ExampleLU Wei，LU Jiang*（School of Life and Health Engineering，Hubei University of Technology，Wuhan 430000，China）Abstract:The comparative teaching method was applied in the experimental teaching of High Performance LiquidChromotography（HPLC）and High Performance Liquid Chromotography-Mass Spectrometry（HPLC-MS）by takingthe determination of carbofuran in tomato juice as an example.In the theoretical teaching part，the similarities anddifferences of the discipline，structure，application in the determination of carbofuran between HPLC and HPLC-MSand their determination of carbofuran were compared.In the practical operation part，different results were given byHPLC and HPLC-MS since the carbofuran content in tomato juice was lower than the detection limit of detection ofHPLC method but higher than that of HPLC-MS method.The teaching efficiency and the comprehensive applicationability of students for large-scale instruments were increased substantially by the comparative teaching method，whichis meaningful to the application-oriented talent cultivation in colleges and universities.Key words:comparative teaching method；large-scale instrument；experimental teaching；carbofuran中图分类号：TS20文献标志码：A文章编号：1007-7871（2024）01-0051-06收稿日期：2023-03-17项目基金：湖北省教学研究项目（省2020459），湖北省高等学校实验室工作研究会项目（HBSY2020-26）作者简介：卢薇（1989），实验师，硕士，研究方向为农产品储藏与加工。E-mail：通讯作者：鲁江（1971），高级实验师，博士，研究方向为功能性食品开发。E-mail：随着我国高校科研活动的飞速发展，大型仪器设备已成为科技创新的重要基础和人才培养的有力保障1。随着国民经济的快速发展，国家加大了对高等教育的投入，有力促进了高校学科和实验建设，尤其是实验室大型仪器设备得以大力充实，水平得以显著提升2。然而，大型仪器的管理存在较高难度，尤其是专业性较强的大型仪器，传统实验教学方式效率较低，严重制约了学生实验技能的提升3。高效液相色谱仪（HPLC）是一种经典的分析仪器，广泛应用于生物、食品、制药、环境等领域，许多高校已开对比教学法在大型仪器实验教学中的应用以番茄汁中克百威的检测为例卢薇，鲁江*（湖北工业大学生命科学与健康工程学院，湖北武汉430000）51饮 料 工 业2024，Vol.27，No.1教学实践展相关的实验教学4。然而，由于教学硬件、教学课时等条件制约，HPLC 的实验课程基本局限于紫外检测器的学习，极少涉及其他检测器和柱后衍生技术，不利于学生对该仪器技术的全面掌握。液相色谱-质谱联用仪（HPLC-MS）将 HPLC 与质谱仪（MS）串联使用，集 HPLC 的高分离能力与 MS 的高专属性于一体，是当今分析化学中最重要的定性与定量分析之一5。由于 HPLC-MS 的灵敏度极高，在部分检测项目中已出现替代 HPLC 的趋势6，7。但该类仪器价格昂贵，操作复杂，各高校的 HPLC-MS 多采用专人专管、委托测试的方式运行，实验教学较为滞后8。湖北工业大学生物工程与食品学院大型仪器共享平台现有 6 台HPLC，2 台 HPLC-MS，相关仪器管理教师定期以传统教学法进行实验教学，但学生对仪器的使用只停留在“单打一”的水平上，难以透彻理解仪器的原理并熟练应用仪器技术。对比教学法是一种通过分析教学内容的异同和内在联系来制定教学方案的教学方法，将一些相关、相似或有联系、区别的教学内容同步进行讲授，以促进学生对课程的深入理解，在高校教学中已有应用实例9，10。在实验教学过程中，老师采用对比教学法，将零碎、孤立的知识点集中串联起来，从新角度对知识进行细化、分解和重构，可培养学生发散思维的能力并达到巩固知识的目的11。以番茄汁中克百威的检测为例，将对比教学法应用于具有一定相关性的 HPLC 和 HPLC-MS 实验教学中，以期加强学生对检测技术的全面掌握，培养出能分析和解决实际问题的高素质人才。1 1材料与方法材料与方法1.1材料与试剂番茄湖北工业大学菜市场；克百威标准品（100ug/mL）上海安谱实验科技股份有限公司；巯基乙醇（RSH）、邻苯二 甲 醛（OPA）稀 释 液（CB910）、0.05mol/L NaOH 溶 液（CB130）美国皮克林公司；色谱级甲醇、色谱级甲酸、色谱级乙腈赛默飞世尔科技公司；QuEChERS 净化包（400mg PSA，400mg C18，400mg GCB，1200mg Mg-SO4）深圳逗点技术生物有限公司；其余试剂均为分析纯。1.2仪器与设备Thermo U3000 高效液相色谱仪（配 FLD 荧光检测器）、Thermo Q-Exactive 液质联用仪（配 ESI 源）美国赛默飞公司；PCR1500 柱后衍生装置中世沃克（天津）科技发展股份有限公司。1.3方法1.3.1克百威标准溶液的配制准确量取 50L 的克百威标品（100g/mL），乙腈定容至 10mL，配制成 500ng/mL 的标准品中间液。分别准确量取 1，2mL 标准中间液（500ng/mL），乙腈定容至 10mL，配制成浓度为 50，100ng/mL 的标准溶液。分别准确量取20，50，100，500，1000，2500L 标准溶液（50ng/mL），乙腈定容至 5mL，配制成浓度 0.2，0.5，1，5，10，25ng/mL的标准溶液。1.3.2样品加标及前处理取 500g 经预实验确证不含克百威的番茄，洗净、去皮、切碎并匀浆后制得番茄汁。向番茄汁中加入 20L 克百威标液（100g/mL），充分混匀后取 10g 番茄加标浆液，准确加入 20mL 乙腈，震荡 10min，加入 5gNaCl 和 10g 无水 MgSO4，震荡 10min，5000r/min 下离心 5min，上清液为萃取液。取萃取液 5mL，加入 QuEChERS 净化包一包，涡旋混匀 2min 后，8000r/min 离心 5min，取上清液过0.22m 滤膜待测。1.3.3仪器条件HPLC 法：色谱柱：Welch Ultimate AQ-C18（4.6150mm，5m）；柱温 30；流动相：A 为甲醇，B 为水；梯度洗脱程序：0min5min，10%90%A，5min8min，90%A，8min8.01min，90%10%A，8.01min12min，10%A；流速 0.7mL/min。柱后衍生采用 OPA 衍生试剂（0.2gRSH溶于1L OPA稀释液）和NaOH溶液（0.05mol/L），流速 0.3mL/min，衍生池温度 95。激发波长 330nm，发射波长 465nm。HPLC-MS 法：色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18（2.150mm，1.8m）；柱温 30；流动相：A 为 0.1%甲酸甲醇溶液，B 为 0.1%甲酸水溶液；梯度洗脱程序：0min4min，10%90%A，4min7min，90%A，7min7.01min，90%10%A，7.01min10min，10%A；流速：0.2mL/min；离子化模式：ESI 源，正离子模式；质谱检测模式：Targeted-SIM/dd-MS2；母离子：222；电离电压 3.5KV；毛细管温度 320；雾化气温度 350；鞘气流量：40arb；辅助气流量：10arb；碰撞能：10%NCE。2 2对比教学法在色谱对比教学法在色谱、质谱实验教学中的应用质谱实验教学中的应用2.1课程设计克百威是一种高毒农药，可抑制鱼类、鸟类和哺乳动物体内胆碱酯酶活性并造成急性中毒和死亡12，13，我国农业部已于 2002 年禁止其在蔬菜、果树、茶叶和中草药材中使用。然而，作为农业生产大国，我国的农药施用量约为14kg/hm2，环境中残存的克百威不可避免地导致了其在果蔬中的残留14，15。Lv 等16通过对我国内陆的 36000 份果蔬样品进行检测，发现仍有 2.0%的水果和 2.3%的蔬菜可检出克百威残留。HPLC 法17和 HPLC-MS18法均可用于果蔬制品中克百威残留量的检测。HPLC 与 HPLC-MS 的色谱522024，Vol.27，No.1饮 料 工 业教学实践分离模块构造基本相同，但二者的检测器不同，导致其测试原理和测试结果存在较大差异。HPLC-MS 的专属性和灵敏度远高于 HPLC，对于痕量物质如农药残留的测定，HPLC 法可能得出假阴性的结果，而 HPLC-MS 法可准确进行定性定量分析。教师通过预实验挑选出一批不含克百威的番茄样品，在课前完成样品匀浆并加标至克百威含量为 4g/kg。该含量低于 HPLC 法检出限（1g/kg），但高于HPLC-MS 法检出限（10g/kg），故针对同一样品，两种仪器将得出截然不同的检测结果。鉴于实验室硬件配置、实验安全等方面的因素，该课程主要针对研究生开展教学，学生具有较好的理论基础和动手能力，并严格控制每次实验教学的人数，以提高教学效率。教师通过预实验对色谱、质谱条件进行优化，并完成方法学验证。实验课程中，教师先针对两种仪器技术及其在克百威检测中原理和分析方法的异同，以对比教学法完成理论教学，然后引导学生以三人小组的方式完成两种方法的前处理、上机测试和数据分析。该课程的设计有利于促进学生主动探究导致实验结果出现差异的根本原因，从而对仪器技术产生更为深刻的认知。2.2理论教学部分2.2.1仪器技术的对比教学为更直观地对比 HPLC 和 HPLC-MS 技术，教师引导学生在课内绘制对比总结表，以对比教学法总结两种技术在仪器原理、构造、应用范围和应用特点等方面的异同，帮助学生初步了解仪器基础知识。针对本实验教学中所使用的 HPLC 和 HPLC-MS，对比总结表见表 1。表 1HPLC 与 HPLC-MS 仪器技术的对比总结表Table 1Comparison of HPLC with HPLC-MS技术类型仪器原理仪器构造应用范围应用特点HPLC色谱法基于待测物在固定相和流动相之间作用的不同，通过待测物在两相之间进行分配以实现色谱分离，测试分离后待测物的光学性质、化学性质或物理性质。高压输送系统、分离系统、进样系统、检测器、衍生装置（非必需）根据化合物性质选择合适的检测器使用、维护成本较低；特殊样品需进行较为复杂的处理；不同检测器的灵敏度存在较大差异HPLC-MS色谱-质谱联用法经色谱法分离后的待测物以离子的形式进入质谱，母离子可进一步碎裂成子离子，质量分析器对相关离子信息进行分析。高压输送系统、分离系统、进样系统、离子源、四极杆、碰撞池、质量分析器中高级性化合物（ESI 源），中低极性化合物（APCI 源）使用、维护成本较高；样品处理一般较为简单；灵敏度极高，选择性强。由于 HPLC-MS 的测试模式较为复杂，教师以平台现有的 Q-Exactive 质谱为例，引导学生在课内绘制对比总结表，以对比教学法总结 HPLC-MS 常用的三种测试模式的异同，加强学生对质谱技术的掌握。HPLC-MS 不同检测模式的对比总结见表 2。表 2HPLC-MS 不同检测模式的对比总结表Table 2Comparison of the different detection modes of HPLC-MS检测原理示意图采集信息Full MS扫描一段质荷比范围内的离子。母离子质荷比和离子强度Targeted SIM四级杆筛选出测定特定质荷比的离子。母离子质荷比和离子强度Targeted-SIM/dd-MS2四级杆筛选出测定特定质荷比的母离子，通过高能碰撞池碎裂成子离子母离子和子离子的质荷比及离子强度2.2.2克百威检测原理的对比教学针对克百威的检测，教师引导学生在课内绘制对比总结表，以对比教学法总结 HPLC 和 HPLC-MS 检测克百威的原理及分析方法的异同，促使学生深入理解检测技术，HPLC 和 HPLC-MS 技术检测克百威的对比总结见表 3。53饮 料 工 业2024，Vol.27，No.1教学实践表 3HPLC 和 HPLC-MS 技术检测克百威的对比总结表Table 3Comparison of the determination of carbofuran by HPLC and HPLC-MS仪器检测原理检测原理示意图定性方式定量方式HPLC（配 FLD 检测器）经色谱柱分离的克百威通过柱后衍生装置在高温碱性条件下与 OPA、RSH 衍生后生成具有强荧光性的异吲哚衍生物，以荧光检测器测试其光强19。保留时间峰面积HPLC-MS（配 ESI 源）经色谱柱分离的克百威在高温、高压和氮气作用下雾化成加 1 个 H+的母离子，以 Targeted-SIM/dd-MS2模式通过质量分析器对其进行检测20。保留时间、母离子质荷比、子离子质荷比母离子或子离子峰面积2.3上机实操部分2.3.1标准曲线与线性范围学生小组取配置好的克百威系列标液上机测试，以浓度（x）为横坐标，HPLC 法以峰面积（y）为纵轴，HPLC-MS法以母离子峰面积（y）为纵轴，绘制标准曲线，并进行回归分析，检出限按信噪比=3 计算，结果见表 4。由表可知，HPLC-MS 法的检出限低于 HPLC 法，有利于学生直观感知 HPLC-MS 的灵敏性。表 4HPLC 和 HPLC-MS 技术检测克百威的回归方程、线性范围、相关系数（R2）和检出限Table 4Comparison of the regression equations，linearranges，correlation coefficients（R2）and detection limitsof carbofuran determined by HPLC and HPLC-MS标准曲线线性范围/（ng/mL）相关系数/R2检出限/（g/kg）HPLC 法y=5.328104x-1.26910411000.999510HPLC-MS 法y=3.87595105x-1.7691050.2250.999112.3.2样品测试引导学生小组完成番茄汁的前处理后上机检测，见图1。由图 1（a）可知，HPLC 法中克百威标品的保留时间为7.30min。由图 1（b）可知，样品在 7.30min 未出峰，但在5min 前出现杂峰，这是体系中存在部分杂质干扰；由图 1（c）、图 1（d）可知，HPLC-MS 法中克百威标品和样品在5.26min 时均出峰；由图 1（e）、图 1（f）可知，图 1（c）、图1（d）中色谱峰的母离子均为 221，子离子均为 165 和 123，且子离子相对丰度极为接近，可定性样品中色谱峰为克百威。通过计算可得 HPLC-MS 法检出番茄汁中克百威含量为 3.12g/kg，与实际含量（4g/kg）存在一定差异，这主要是由于基质抑制效应及回收率等因素引起的。由于该含量低于 HPLC 法的检出限（10g/kg），HPLC 法未检出克百威。相同的样品用不同的仪器检测，得到截然不同的检测结果，学生可在全面掌握仪器操作的同时对仪器分析技术产生本质上的认知，培养学生综合运用分析仪器的能力。542024，Vol.27，No.1饮 料 工 业教学实践图 1HPLC 法测得标液（a）和样液（b）的色谱图；HPLC-MS 法测得标液（c）和样液（d）的提取离子流图；HPLC-MS 法测得标液（e）和样液（f）的二级质谱图Fig.1HPLC chromatography of the standard（a）and the sample（b）；HPLC-MS extracted ion chromatography of the standard（c）and the sample（d）；secondary mass spectrum of the standard（e）and the sample（f）3 3教学效果教学效果2021 年，平台延用传统教学法进行大型仪器实验教学，即针对单台仪器对学生进行原理讲解和上机实操；2022 年，平台将对比教学法应用于 HPLC 和 HPLC-MS 的实验教学中。实验教学结束后，教师采用提问、上机操作的方式对学生进行考核，授予学生自主上机、半自主上机资格，上机资格人数可有效评估教学效果，见表 5。由于HPLC 的操作较为简单，参与传统教学的学生大部分能较好地掌握 HPLC 的使用，对比教学法仅小幅提升了 HPLC自主、半自主上机人数，但大量学生反馈对比教学法可加深其对 HPLC 原理和应用范围的深入理解，对学生在科研过程中测试方法的选择有极大助益。HPLC-MS 的专业性较强，操作复杂，传统教学法的教学效率较低，多数学生难以掌握其操作，亦不能深刻理解其在检测中的优势，获得上机资格的人数较少。对比教学法自实施以来，学生的学习兴趣大幅提高，报名参加课程及考核的人数显著提升，获取上机资格的人数由 2021 年的 6 人提升至 2022 年的 42 人，教学效果显著改善。表 5不同教学法教学效果评估表Table 5The evaluation sheet of the teaching efficiency underdifferent teaching models20212022HPLC半自主上机人数812自主上机人数4048HPLC-MS半自主上机人数531自主上机人数1955饮 料 工 业2024，Vol.27，No.1教学实践4 4结论结论以番茄汁中克百威的检测为例，将对比教学法应用于大型仪器 HPLC 和 HPLC-MS 的实验教学中。在理论教学部分，对比 HPLC 和 HPLC-MS 的仪器原理、构造、应用范围和应用特点，帮助学生初步了解仪器基础知识，然后对比 HPLC-MS 三种常见检测模式的原理，加强学生对质谱技术的掌握；最后对比两种方法检测克百威的原理和定性、定量方式等方面的异同，促使学生深入理解相关检测技术。在上机实操部分，先引导学生绘制标曲并计算检出限，HPLC-MS 法的检出限低于 HPLC 法，有利于学生直观感受 HPLC-MS 的灵敏性；然后引导学生完成样品的上机检测，由于番茄汁中克百威含量低于 HPLC 法的检出限但高于 HPLC-MS 法的检出限，HPLC-MS 法检出番茄汁中的克百威残留，而 HPLC 法未检出，有助于学生在掌握仪器操作的同时对分析技术产生本质上的认知。自 2022 年实施对比教学法以来，学生的学习兴趣大幅提高，获取上机资格的总人数由 2021 年的 54 人提升至目前的 102 人，教学效果显著改善。对比教学法切实提高了实验教学效率，提升了学生的大型仪器综合运用能力，对高校应用型人才的高质量培养具有重要意义。参考文献：1胡鹏飞，谢忱，马村成，等.高校分析测试中心大型仪器共享平台建设探索J.实验室研究与探索，2019，38（10）：256-258.2王杰，王妮，李盼，等.大型科研仪器设备开放共享的探索与实践J.实验室研究与探索，2019，38（12）：297-303.3韩长杰，张静，郭辉.高校大型仪器设备使用管理模式探讨J.实验室研究与探索，2018，37（3）：286-288.4赵玉红，李欣，崔建林，等.维生素C含量检测实验的改革J.实验技术与管理，2016，33（6）：63-65.5高越颖，刘蕾，惠人杰.液质联用技术应用于药理学实验教学的探索J.实验室研究与探索，2019，38（11）：219-222.6张立佳，莫楠，刘丽君.超高效液相色谱-串联质谱法测定乳饮料中香兰素的不确定度评定J.饮料工业，2022，25（1）：12-17.7柯润辉，王丽娟，安红梅，等.超高效液相色谱-质谱/质谱法快速测定饮料中8种甜味剂J.饮料工业，2013，16（9）：35-38.8林森，罗亮，姚帮本，等.高效液相色谱-串联质谱法测定植物性食品中多种农药残留J.分析实验室，2017（1）：114-119.9陈勇.分析化学教学中对比教学法的探究J.广州化工，2015，43（13）：194-195.10余祥英，李玉婷，周亚民，等.基于“共性-个性”挖掘的对比教学法在仪器分析教学中的应用J.广东化工，2021，48（23）：223-224.11苗萌，李佳，张静怡，等.对教学法在 仪器分析 质谱教学中的应用J.广州化工，2021，49（6）：123-125.12Kempuraj D，ZHANG E，GUPTA S，et al.Carbofuran pesticidetoxicity to the eyeJ.Experimental Eye Research，2023，227：109355.13ZHANG Bei，Hiramatsu T，HAMANO S，et al.Swiss-roll elec-trodes for efficient degradation of carbofuran by electrochemicaladvanced oxidation 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