生物素亲和素市公开课一等奖百校联赛特等奖课件.pptx
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1、生物素生物素-亲和素标识技术亲和素标识技术食安食安05010501类春燕类春燕 孙隽孙隽 陈春艳陈春艳 孙晓丽孙晓丽 李臻佳李臻佳第1页是生物体内广泛分布一个羧化酶辅是生物体内广泛分布一个羧化酶辅酶,分子中有两个环状结构:酶,分子中有两个环状结构:环为咪唑酮环,是与亲和素结环为咪唑酮环,是与亲和素结合主要部位。合主要部位。环为噻唑环,上有一戊酸侧链,环为噻唑环,上有一戊酸侧链,其末端羧基是结合抗体和其它生物其末端羧基是结合抗体和其它生物大分子(如:酶、蛋白质、抗体、大分子(如:酶、蛋白质、抗体、DNA)唯一结构。)唯一结构。生物素生物素(Biotin)辅酶R、维生素H第2页 利用生物素羧基加以
2、化学修饰可制成各种活性利用生物素羧基加以化学修饰可制成各种活性生物素,以适合与各种生物大分子结合需要。生物素,以适合与各种生物大分子结合需要。主要有用于标识蛋白质氨基生物素主要有用于标识蛋白质氨基生物素N羟基丁羟基丁二酰亚胺酯(二酰亚胺酯(BNHS)和生物素对硝基酚酯)和生物素对硝基酚酯(pBNP),其中以其中以BNHS最为惯用。近年来,应最为惯用。近年来,应用长臂生物素(用长臂生物素(BCNHS)标识生物大分子,)标识生物大分子,能够降低位阻效应,增加检测灵敏度和特异性。能够降低位阻效应,增加检测灵敏度和特异性。用于标识蛋白质醛基、巯基和糖基衍生物有生用于标识蛋白质醛基、巯基和糖基衍生物有生
3、物素酰肼(物素酰肼(BHZ)及肼化生物素()及肼化生物素(BCHZ)。)。第3页第4页亲和素(亲和素(Avidin)抗生物素蛋白、抗生物素 是从鸡蛋清中提取一个糖蛋白,它是从鸡蛋清中提取一个糖蛋白,它由四个相同氨基酸亚基组成,亚基由四个相同氨基酸亚基组成,亚基之间经过二硫键连接,亲和素每一之间经过二硫键连接,亲和素每一个亚基含有一个与生物素结合位点,个亚基含有一个与生物素结合位点,并与生物素或其衍生物形成高度稳并与生物素或其衍生物形成高度稳定复合物。定复合物。第5页基本原理基本原理生物素与抗体共价交联方法简单,条件温生物素与抗体共价交联方法简单,条件温和,且普通不影响抗体活性。生物素与亲和,且
4、普通不影响抗体活性。生物素与亲和素能快速结合,而且反应不受外界干扰,和素能快速结合,而且反应不受外界干扰,含有高度特异性和稳定性,二者亲和常数含有高度特异性和稳定性,二者亲和常数比抗原抗体反应高比抗原抗体反应高10100万倍,结合快,万倍,结合快,呈不可逆反应,而且在呈不可逆反应,而且在pH,温度、有机溶,温度、有机溶剂或变性剂较大改变范围内均能稳定存在。剂或变性剂较大改变范围内均能稳定存在。第6页第7页生物素亲和素系统(生物素亲和素系统(BASBAS)用于检测基本方法有三类:)用于检测基本方法有三类:I.标识亲和素连接生物素化大分子反应体系,标识亲和素连接生物素化大分子反应体系,称称BA法,
5、或标识亲和素生物素法法,或标识亲和素生物素法(LBA)。)。II.以亲和素两端分别连接生物素化大分子反以亲和素两端分别连接生物素化大分子反应体系和标识生物素,称为应体系和标识生物素,称为BAB法法,或桥,或桥联亲和素生物素法(联亲和素生物素法(BRBA)。)。III.将亲和素与酶标生物素共温形成亲和素将亲和素与酶标生物素共温形成亲和素生物素过氧化物酶复合物,再与生物素生物素过氧化物酶复合物,再与生物素化抗抗体接触时,将抗原抗体反应体系化抗抗体接触时,将抗原抗体反应体系与与ABC标识体系连成一体,称为标识体系连成一体,称为ABC法法,其中其中AAb为亲和素化抗体,为亲和素化抗体,B-Ab为生物为
6、生物素化抗体。素化抗体。第8页1.BA-酶免疫技术原理亲和素可预包被在酶标板孔内,然后再亲和素可预包被在酶标板孔内,然后再将生物素化抗体将生物素化抗体Ab(Ab(或抗原或抗原Ag)Ag)包被于孔包被于孔内。经过内。经过BABA将免疫复合物与酶连接起来,将免疫复合物与酶连接起来,能有效地放大能有效地放大EIA法,使其灵敏性增强。法,使其灵敏性增强。第9页优点优点生物素反抗体和酶生物素反抗体和酶标识率高标识率高,又不影响其它,又不影响其它活性。活性。生物素亲和素结合生物素亲和素结合极为稳定极为稳定,不会在孵育和,不会在孵育和各种洗涤过程中脱落。各种洗涤过程中脱落。每个亲和素分子能结合每个亲和素分子
7、能结合4个生物素,能耦合个生物素,能耦合更多联结生物素酶分子,更多联结生物素酶分子,提升提升EIA敏感性。敏感性。第10页双抗体夹心生物素双抗体夹心生物素-亲和素亲和素ELISA法检测法检测 相思子毒素相思子毒素用亲和素用亲和素-生物素生物素ELISA检测检测GPV抗体抗体生物素亲和素放大酶联免疫吸附法测定双生物素亲和素放大酶联免疫吸附法测定双酚酚A第11页2.BA-分子生物学技术 将引物生物素化,经过将引物生物素化,经过PCR反应后反应后,用用(链霉链霉)亲和素亲和素固定扩增产物,进行下一步显色或荧光等检测。固定扩增产物,进行下一步显色或荧光等检测。生物素化引生物素化引物扩增目标物扩增目标基
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