生物素-亲和素反应的放大技术省公共课一等奖全国赛课获奖课件.pptx

生物素生物素-亲合素放大技亲合素放大技术术第1页第二节第二节 亲合素、链霉亲合素理化性质与标识亲合素、链霉亲合素理化性质与标识一、理化特征一、理化特征二、亲合素（或链酶亲合素）标识二、亲合素（或链酶亲合素）标识第一节第一节 生物素理化性质与标识生物素理化性质与标识一、活化生物素一、活化生物素二、活化生物素标识蛋白质二、活化生物素标识蛋白质第2页第三节第三节 生物素生物素-亲合素系统特点亲合素系统特点一、灵敏度二、特异性一、灵敏度二、特异性三、稳定性四、适用性三、稳定性四、适用性五、其它五、其它思索题思索题小结小结第四节第四节 生物素生物素-亲合素系统应用亲合素系统应用一、生物素一、生物素-亲合素系统基本类型及原理亲合素系统基本类型及原理二、生物素二、生物素-亲合素系统在酶免疫测定中应用亲合素系统在酶免疫测定中应用三、生物素三、生物素-亲合素系统在荧光免疫技术中应用亲合素系统在荧光免疫技术中应用四、生物素四、生物素-亲合素系统在放射免疫测定中应用亲合素系统在放射免疫测定中应用五、生物素五、生物素-亲合素系统在分子生物学中应用亲合素系统在分子生物学中应用第3页生物素（生物素（biotinbiotin）、亲和素）、亲和素（avidinavidin）是一对含有高度亲）是一对含有高度亲和力物质，结合快速、专一、和力物质，结合快速、专一、稳定并含有多级放大效应。稳定并含有多级放大效应。BABBAABC第4页生物素（维生素生物素（维生素H H）动、植物组织中广泛动、植物组织中广泛 分布分布,卵黄和肝含量高卵黄和肝含量高分子量小，分子量小，244.31 D244.31 DI I环为咪唑酮环，可与亲合环为咪唑酮环，可与亲合 素结合素结合环为噻吩环，环为噻吩环，C2C2上戊酸侧链未端羧基是结合生物大分上戊酸侧链未端羧基是结合生物大分子唯一结构子唯一结构 I I I I 咪唑酮环咪唑酮环咪唑酮环咪唑酮环 噻吩环噻吩环噻吩环噻吩环 羧基羧基:可用于活化为其它衍可用于活化为其它衍生物生物第一节第一节 生物素理化性质与标识生物素理化性质与标识第5页一、活化生物素一、活化生物素 生物素侧链末生物素侧链末端羧基经化学修端羧基经化学修饰后制成带各种饰后制成带各种活性基团衍生活性基团衍生物物活化生物素活化生物素(生物素化衍生物生物素化衍生物)为何要活化？为何要活化？第6页活化生物素活化生物素活化生物素易活化生物素易与抗原、抗体、与抗原、抗体、酶及核酸分子酶及核酸分子中对应基团偶中对应基团偶联形成生物素联形成生物素化标识物化标识物 标识蛋白质标识蛋白质氨基氨基活化生物素活化生物素 标识蛋白质标识蛋白质醛基醛基活化生物素活化生物素 标识蛋白质标识蛋白质巯基巯基活化生物素活化生物素 标识标识核酸核酸活化生物素活化生物素 第7页活化生物素活化生物素标识蛋白质氨基活化生物素标识蛋白质氨基活化生物素BNHSBNHS分子可与蛋白质分子可与蛋白质 赖氨酸赖氨酸（碱性（碱性AAAA）氨基形成肽键氨基形成肽键 BNHSBNHS适用标识抗体和适用标识抗体和 中性或偏碱性中性或偏碱性蛋白质蛋白质生物素生物素N-N-羟基丁二酰胺羟基丁二酰胺碳二亚胺碳二亚胺生物素羟生物素羟基琥珀酰基琥珀酰亚胺酯亚胺酯(BNHS)(BNHS)第8页怎样减小空间位阻怎样减小空间位阻长臂活化生物素长臂活化生物素（BCNHSBCNHS）：）：生物素和生物素和N-N-羟基丁二酰亚胺之间添加了两个羟基丁二酰亚胺之间添加了两个6-6-氨基已糖分子基团，形成连结臂，生物素氨基已糖分子基团，形成连结臂，生物素与大分子基团距离增加，更易发挥生物素活与大分子基团距离增加，更易发挥生物素活性作用。性作用。生物素分子量小，当与抗体或酶形成生物素标识结合物后，因为大分子蛋白空间位阻效应，可对生物素与亲和素结合以及BAS应用效果造成干扰。第9页标识蛋白质醛基活化生物素标识蛋白质醛基活化生物素生物素酰肼生物素酰肼(BHZ)(BHZ)：水合肼与生物素合成物水合肼与生物素合成物 主要用于标识主要用于标识偏酸性偏酸性糖蛋白糖蛋白 肼化生物胞素肼化生物胞素(BCHZ)(BCHZ)：生物素与赖氨酸连接后，：生物素与赖氨酸连接后，再与无水肼反应而成。再与无水肼反应而成。除醛基外，除醛基外，BCHZBCHZ还可标识氨基还可标识氨基第10页标识蛋白质巯基活化生物素标识蛋白质巯基活化生物素马来酰亚胺马来酰亚胺-丙酰丙酰-生物胞素（生物胞素（MPB)MPB)：能特异地与蛋白质巯基结合活化生物素能特异地与蛋白质巯基结合活化生物素 第11页标识核酸活化生物素标识核酸活化生物素光生物素光生物素(photobiotin)(photobiotin)光敏物质光敏物质 侧链上连接侧链上连接芳香基叠氮物基团芳香基叠氮物基团,经光照后经光照后,变为芳香基硝基变为芳香基硝基苯，可直接与腺嘌呤氨基结合苯，可直接与腺嘌呤氨基结合,形成形成B-B-核酸探针，用于核酸探针，用于DNADNA或或RNARNA标识。标识。生物素脱氧核苷三磷酸（如生物素脱氧核苷三磷酸（如Bio-dUTPBio-dUTP）作为作为TTPTTP结构类似物，可采取缺口移位法（结构类似物，可采取缺口移位法（DNase IDNase I和和DNADNA聚合聚合酶酶I I）掺入到双链）掺入到双链DNADNA中。中。BNHSBNHS和和BHZBHZ 可直接标识核酸，但对碱基配对有影响。可直接标识核酸，但对碱基配对有影响。当前惯用光生物素和生物素化当前惯用光生物素和生物素化dUTPdUTP作为标识核酸活化生物素。作为标识核酸活化生物素。第12页特征：特征：活化生物素经过侧链与蛋白分子连接；活化生物素经过侧链与蛋白分子连接；一个蛋白分子可被多个生物素标识多价性（是一个蛋白分子可被多个生物素标识多价性（是BAS多级放大多级放大作用物质基础）；作用物质基础）；BNHS多标识抗体和中性或偏碱性蛋白质多标识抗体和中性或偏碱性蛋白质,BHZ则多标识微酸则多标识微酸性抗原；抗原、抗体标识后活性不变；性抗原；抗原、抗体标识后活性不变；可对标识材料（如酶）标识：碱性磷酸酶标识后，活性降低；可对标识材料（如酶）标识：碱性磷酸酶标识后，活性降低；二、活化生物素标识蛋白质二、活化生物素标识蛋白质第13页注意事项：注意事项：选择活化生物素：选择活化生物素：依抗原或抗体分子所带可标识基团依抗原或抗体分子所带可标识基团 种类（氨基、醛基或巯基）以及分子酸碱性；种类（氨基、醛基或巯基）以及分子酸碱性；控制生物素：蛋白质百分比控制生物素：蛋白质百分比 生物素：生物素：IgG IgG 用量比用量比(mg/mg)宜为宜为2:1,IgG2:1,IgG应用浓度应用浓度 0.50.55 5g/ml;生物素生物素1 13 3个个/Ag/Ag，3 35 5个个/Ab/Ab；使用交联臂降低空间阻力使用交联臂降低空间阻力第14页第二节第二节 亲合素、链霉亲合素理化亲合素、链霉亲合素理化性质与标识性质与标识亲合素亲合素(avidin,AV)和链霉亲合素和链霉亲合素(streptavidin,SA)是生物素天然特异性结合物。是生物素天然特异性结合物。而且，而且，二者均为二者均为大分子蛋白大分子蛋白，所以几乎全部用，所以几乎全部用于标识物质均能够同亲合素（于标识物质均能够同亲合素（AV）或链酶亲合）或链酶亲合素（素（SA）结合）结合。第15页结构结构 四亚基糖蛋白四亚基糖蛋白 四肽链蛋白四肽链蛋白 无糖基无糖基PI PI 10.5 610.5 6结合位结合位 色氨酸色氨酸 色氨酸色氨酸生物素生物素 4 44 4Ka Ka 10 1015 15 10 101515活性活性 131315U 1515U 1518U18U亲合素（亲合素（亲合素（亲合素（AVAVAVAV）链霉亲合素链霉亲合素链霉亲合素链霉亲合素(SA)(SA)(SA)(SA)一、理一、理 化化 特特 性性SASA表面所带正电荷少，且不含糖基，非特异性结合表面所带正电荷少，且不含糖基，非特异性结合远低于远低于AVAV，所以当前以，所以当前以SASA标识酶结合物更为惯用。标识酶结合物更为惯用。第16页二、亲合素二、亲合素/链霉亲合素标识链霉亲合素标识v可标识可标识AV/SAAV/SA物质：物质：酶、抗原或抗体、铁蛋白、酶、抗原或抗体、铁蛋白、胶体金、胶体金、125125I I、异硫氰酸荧光素（、异硫氰酸荧光素（FITCFITC）等。）等。vHRP-AV(SA)（酶标识蛋白直接标识法）：酶标识蛋白直接标识法）：过碘酸钠法、戊二醛法。过碘酸钠法、戊二醛法。vABC/SABC：经过与生物素化酶复合物中经过与生物素化酶复合物中 生物素结合，间接地与酶形成结合物。生物素结合，间接地与酶形成结合物。AV(SA)+B-HRP/ALP ABC(avidin-biotin-peroxidase comlplex)/ABAP 第17页第三节第三节 生物素生物素-亲合素系统亲合素系统(BAS)(BAS)特点特点灵敏度高灵敏度高:生物素标识蛋白含有多价性，且标识后抗原生物素标识蛋白含有多价性，且标识后抗原/抗抗体生物活性不变，每个亲合素有四个生物素结合部位，可同时体生物活性不变，每个亲合素有四个生物素结合部位，可同时以多价形式结合到生物素化大分子衍生物和标志物上，所以，以多价形式结合到生物素化大分子衍生物和标志物上，所以，BASBAS含有多级放大作用，反应灵敏度高。含有多级放大作用，反应灵敏度高。稳定性高和特异性强：稳定性高和特异性强：AV/SAAV/SA与生物素结合亲和与生物素结合亲和常数比抗原常数比抗原-抗体反应最少高抗体反应最少高1 1万倍，二者结合呈高度专一性和万倍，二者结合呈高度专一性和不可逆性，且酸、碱、变性剂、蛋白溶解酶、有机溶剂以及反不可逆性，且酸、碱、变性剂、蛋白溶解酶、有机溶剂以及反应试剂高度稀释均不影响其结合。所以，应试剂高度稀释均不影响其结合。所以，BASBAS稳定性高，特异性稳定性高，特异性强。强。第18页第三节第三节 生物素生物素-亲合素系统亲合素系统(BAS)(BAS)特点特点适用性广泛：适用性广泛：BAS多级放大作用，以及既可多级放大作用，以及既可 偶联生物大分子，又可连接标识材料，使偶联生物大分子，又可连接标识材料，使BAS不不 仅用于微量抗原、抗体及受体定量、定性检测仅用于微量抗原、抗体及受体定量、定性检测 及定位观察研究，亦可制成亲和介质用于上述各及定位观察研究，亦可制成亲和介质用于上述各 类反应体系中反应物分离、纯化。类反应体系中反应物分离、纯化。其它：其它：可制成通用试剂（如生物素化二抗等）；可制成通用试剂（如生物素化二抗等）；反应试剂可高度稀释，尤其是与一抗偶联使用可反应试剂可高度稀释，尤其是与一抗偶联使用可 大幅降低一抗用量，降低试验成本；试验所需时大幅降低一抗用量，降低试验成本；试验所需时 间不长。间不长。第19页第四节第四节 生物素生物素-亲合素系统应用亲合素系统应用生物素与亲合素之间结合亲协力生物素与亲合素之间结合亲协力高、特异性强，各自均能够与各型大高、特异性强，各自均能够与各型大小分子结合，以及二者在结合反应时小分子结合，以及二者在结合反应时含有多级放大作用等优越性，使含有多级放大作用等优越性，使BASBAS及及其相关技术被广泛应用在各种标识免其相关技术被广泛应用在各种标识免疫分析技术领域中，尤其为疫分析技术领域中，尤其为标识免疫标识免疫检测自动化分析检测自动化分析做出了极大贡献。做出了极大贡献。第20页一、生物素一、生物素-亲合素系统基本类型亲合素系统基本类型及原理及原理BABBAB法：法：Ag+BAg+BAb Ag-AbAb Ag-AbB B A/SAA/SA Ag-Ab Ag-AbB-B-A/SA A/SA B BE E Ag-Ab Ag-AbB-A/SA-BB-A/SA-BE E 特点：以游离特点：以游离A/SAA/SA分别连接分别连接B-AbB-Ab和和B-E B-E 第21页BABA法，也称标识亲合素法，也称标识亲合素-生物素法生物素法:（labeled avidin-biotin,LABlabeled avidin-biotin,LAB）Ag+BAg+BAb Ag-AbAb Ag-AbB B A AE/SAE/SAE E Ag-AbAg-AbB-A/SAB-A/SAE E特点：以特点：以A AE/SAE/SAE E代替代替BABBAB法中法中A/SAA/SA，省却了加，省却了加B BE E步骤步骤第22页3.3.ABC ABC法法 A+BA+BE A-BE A-BE-ABCE-ABC Ag+B Ag+BAb Ag-AbAb Ag-AbB B ABCABC Ag-Ab Ag-AbB-ABC B-ABC 特点特点:将将BABBAB法中法中A A先与先与B-EB-E结合，制备成复合物结合，制备成复合物 ABC,ABC,网络了大量酶分子，使该法检测灵敏网络了大量酶分子，使该法检测灵敏 度显著提升。度显著提升。第23页BABBAABCBAB与ABC组员相同，反应次序不一样第24页另外，按待检反应体系中所用是生物素化第一抗体或生物素化第二抗体，另外，按待检反应体系中所用是生物素化第一抗体或生物素化第二抗体，BASBAS分为直接法和间接法。分为直接法和间接法。方 法 反应层次 直接法 BA Ag-(Ab-B)-A*BAB Ag-(Ab-B)-A-B*ABC Ag-(Ab-B)-A-B*C 间接法 BA Ag-Ab1-(Ab2-B)-A*BAB Ag-Ab1-(Ab2-B)-A-B*ABC Ag-Ab1-(Ab2-B)-A-B*CBAS试验方法及反应层次第25页二、生物素二、生物素-亲合素系统在酶免疫亲合素系统在酶免疫测定中应用测定中应用BASBAS在在ELISAELISA中应用中应用 ：BASBAS用于固相化抗原用于固相化抗原/抗体制备抗体制备 AV/SAAV/SA先包被固相载体、抗原先包被固相载体、抗原/抗体抗体 先与生物素结合先与生物素结合 AV/SA-BAV/SA-B反应而使抗原反应而使抗原/抗体固相化。抗体固相化。BASBAS用于用于ELISAELISA终反应放大终反应放大 BA-ELISABA-ELISA、BAB-ELISABAB-ELISA、ABC-ELISAABC-ELISABASBAS在均相酶免疫测定中应用：在均相酶免疫测定中应用：B BE E*A A-B A A-BE E（酶因活性中心受空间位阻作用而失活）（酶因活性中心受空间位阻作用而失活）反应系统：反应系统：B BE E*、AgAgA A、AbAb（限量）、标准（限量）、标准Ag/Ag/待检待检AgAgAgAgA A和待检和待检AgAg竞争结合限量竞争结合限量AbAb，若，若Ag AgAg Ag Ab Ag Ab AgA AgA AgA-A-B BE E 酶活性改变与待测标本中抗原浓度呈负剂量相关。酶活性改变与待测标本中抗原浓度呈负剂量相关。（酶活性降低）（酶活性降低）第26页三、生物素三、生物素-亲合素系统在荧光免亲合素系统在荧光免疫技术中应用疫技术中应用 BAS BAS用于荧光抗体技术可显著提升方法灵敏度和用于荧光抗体技术可显著提升方法灵敏度和特异性，通常采取特异性，通常采取BABA法，即用荧光素直接标识法，即用荧光素直接标识亲合素（或链酶亲合素）；也可采取游离亲合亲合素（或链酶亲合素）；也可采取游离亲合素（或链酶亲合素）搭桥，两端分别连接生物素（或链酶亲合素）搭桥，两端分别连接生物素化抗体和荧光素标识生物素（素化抗体和荧光素标识生物素（BABBAB法）或荧法）或荧光标识抗亲合素（或链酶亲合素）抗体夹心法。光标识抗亲合素（或链酶亲合素）抗体夹心法。BASBAS用于时间分辨荧光免疫分析也能够将反应信用于时间分辨荧光免疫分析也能够将反应信号放大。号放大。第27页四、生物素四、生物素-亲合素系统在放射免亲合素系统在放射免疫测定中应用疫测定中应用BASBAS主要与免疫放射分析主要与免疫放射分析(IRMA)(IRMA)检测体系偶检测体系偶联，用于对终反应放大（联，用于对终反应放大（BABA法）法）BASBAS也可用于也可用于IRMAIRMA反应后反应后B B、F F成份分离成份分离 第28页五、生物素五、生物素-亲合素系统在分子生亲合素系统在分子生物学中应用物学中应用以生物素标识核酸探针进行定位检测以生物素标识核酸探针进行定位检测用用BAS制备亲和吸附剂进行基因分离纯化制备亲和吸附剂进行基因分离纯化将免疫测定技术与将免疫测定技术与PCR结合建立结合建立免疫免疫-PCR(immuno-PCR)用于抗原检测用于抗原检测 如如DNADNAB-B-SASAProAProA-IgG-IgG-Ag,Ag,AgAg和和DNADNA间建立对应关系，从而将对蛋白质间建立对应关系，从而将对蛋白质检测转化为对核酸检测，抗原抗体反应特异性与检测转化为对核酸检测，抗原抗体反应特异性与PCRPCR技术高度敏感性相结合，技术高度敏感性相结合，其检测灵敏度可达其检测灵敏度可达1010-21-21molmol水平，水平，是迄今最敏感分析方法是迄今最敏感分析方法。第29页思索题思索题1.1.生物素分子结构特点是什么？生物素分子结构特点是什么？2.2.生物素经过什么结构、形式与生物大分子相连结？生物素经过什么结构、形式与生物大分子相连结？3.3.亲合素或链霉亲合素分子结构、理化性质有何特点？亲合素或链霉亲合素分子结构、理化性质有何特点？4.4.为何亲合素、链霉亲合素含有为何亲合素、链霉亲合素含有“桥联桥联”作用？作用？5.5.亲合素、链霉亲合素能够被哪些示踪剂标识？亲合素、链霉亲合素能够被哪些示踪剂标识？6.6.为何生物素亲合素系统含有放大作用？为何生物素亲合素系统含有放大作用？7.7.生物素与亲合素或链霉亲合素结合是否与抗原抗体结合相同？生物素与亲合素或链霉亲合素结合是否与抗原抗体结合相同？8.8.生物素亲合素系统放大是反应过程还是单一检测信号？生物素亲合素系统放大是反应过程还是单一检测信号？9.9.生物素、亲合素或链霉亲合素怎样与标识免疫技术联接？生物素、亲合素或链霉亲合素怎样与标识免疫技术联接？10.10.怎样将生物素链霉亲合素放大系统用于全部双位点怎样将生物素链霉亲合素放大系统用于全部双位点ELISA?ELISA?第30页小小 结结v生生物物素素亲亲合合素素（链链霉霉亲亲合合素素）系系统统含含有有多多级级放放大大独独特特效效应应，可可极极大大地地提提升升分分析析测测定定灵灵敏敏度度；二二者者之之间间高高亲亲和和、高高特特异异结结合合以以及及既既可可偶偶联联生生物物大大分分子子，又又可可连连接接标标识识材材料料特特征征，使使该该系系统统在在标标识识免免疫疫分分析析技技术术领领域域中中应应用用含含有有很很强强稳稳定定性性和和适适用用性性。该该系系统统有有二二种种基基本本类类型型：以以游游离离亲亲合合素素为为中中间间物物，分分别别连连接接包包含含生生物物素素化化大大分分子子待待检检反反应应体体系系和和标标识识生生物物素素BABBAB法法或或ABCABC技技术术；另另一一类类是是直直接接用用标标识识亲亲合合素素连连接接生生物物素素化化大大分分子子反反应应体体系系进进行行检检测测BABA法法或或LABLAB。另另外外，按按生生物物素素化化第第一一抗抗体体或或生生物物素素化化第第二二抗抗体体，又又分分为为直直接接法法或或间间接接法法BASBAS系统。系统。第31页v在在生生物物素素亲亲合合素素（链链霉霉亲亲合合素素）放放大大系系统统应应用用中中，不不论论采采取取酶酶、荧荧光光素素或或发发光光物物作作为为检检测测示示踪踪剂剂，均均是是待待测测抗抗原原与与生生物物素素化化抗抗体体反反应应形形成成复复合合物物后后，再再利利用用生生物物素素与与亲亲合合素素间间多多价价放放大大结结合合特特征征，或或直直接接与与标标有有示示踪踪剂剂生生物物素素结结合合（BABA、LABLAB法法），或或依依次次与与亲亲合合素素（链链霉霉亲亲合合素素）、生生物物素素示示踪踪标标识识物物反反应应连连接接成成聚聚合合物物（BABBAB、ABCABC法法），最最终终使使待待测测反反应应信信号号被被放放大大，提升检测方法灵敏度。提升检测方法灵敏度。第32页