生物素-亲和素反应的放大技术省公共课一等奖全国赛课获奖课件.pptx
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1、 生物素生物素-亲合素放大技亲合素放大技术术第1页第二节第二节 亲合素、链霉亲合素理化性质与标识亲合素、链霉亲合素理化性质与标识一、理化特征一、理化特征二、亲合素(或链酶亲合素)标识二、亲合素(或链酶亲合素)标识第一节第一节 生物素理化性质与标识生物素理化性质与标识一、活化生物素一、活化生物素二、活化生物素标识蛋白质二、活化生物素标识蛋白质第2页第三节第三节 生物素生物素-亲合素系统特点亲合素系统特点一、灵敏度二、特异性一、灵敏度二、特异性三、稳定性四、适用性三、稳定性四、适用性五、其它五、其它思索题思索题小结小结第四节第四节 生物素生物素-亲合素系统应用亲合素系统应用一、生物素一、生物素-亲
2、合素系统基本类型及原理亲合素系统基本类型及原理二、生物素二、生物素-亲合素系统在酶免疫测定中应用亲合素系统在酶免疫测定中应用三、生物素三、生物素-亲合素系统在荧光免疫技术中应用亲合素系统在荧光免疫技术中应用四、生物素四、生物素-亲合素系统在放射免疫测定中应用亲合素系统在放射免疫测定中应用五、生物素五、生物素-亲合素系统在分子生物学中应用亲合素系统在分子生物学中应用第3页生物素(生物素(biotinbiotin)、亲和素)、亲和素(avidinavidin)是一对含有高度亲)是一对含有高度亲和力物质,结合快速、专一、和力物质,结合快速、专一、稳定并含有多级放大效应。稳定并含有多级放大效应。BAB
3、BAABC第4页生物素(维生素生物素(维生素H H)动、植物组织中广泛动、植物组织中广泛 分布分布,卵黄和肝含量高卵黄和肝含量高分子量小,分子量小,244.31 D244.31 DI I环为咪唑酮环,可与亲合环为咪唑酮环,可与亲合 素结合素结合环为噻吩环,环为噻吩环,C2C2上戊酸侧链未端羧基是结合生物大分上戊酸侧链未端羧基是结合生物大分子唯一结构子唯一结构 I I I I 咪唑酮环咪唑酮环咪唑酮环咪唑酮环 噻吩环噻吩环噻吩环噻吩环 羧基羧基:可用于活化为其它衍可用于活化为其它衍生物生物第一节第一节 生物素理化性质与标识生物素理化性质与标识第5页一、活化生物素一、活化生物素 生物素侧链末生物素
4、侧链末端羧基经化学修端羧基经化学修饰后制成带各种饰后制成带各种活性基团衍生活性基团衍生物物活化生物素活化生物素(生物素化衍生物生物素化衍生物)为何要活化?为何要活化?第6页活化生物素活化生物素活化生物素易活化生物素易与抗原、抗体、与抗原、抗体、酶及核酸分子酶及核酸分子中对应基团偶中对应基团偶联形成生物素联形成生物素化标识物化标识物 标识蛋白质标识蛋白质氨基氨基活化生物素活化生物素 标识蛋白质标识蛋白质醛基醛基活化生物素活化生物素 标识蛋白质标识蛋白质巯基巯基活化生物素活化生物素 标识标识核酸核酸活化生物素活化生物素 第7页活化生物素活化生物素标识蛋白质氨基活化生物素标识蛋白质氨基活化生物素BN
5、HSBNHS分子可与蛋白质分子可与蛋白质 赖氨酸赖氨酸(碱性(碱性AAAA)氨基形成肽键氨基形成肽键 BNHSBNHS适用标识抗体和适用标识抗体和 中性或偏碱性中性或偏碱性蛋白质蛋白质生物素生物素N-N-羟基丁二酰胺羟基丁二酰胺碳二亚胺碳二亚胺生物素羟生物素羟基琥珀酰基琥珀酰亚胺酯亚胺酯(BNHS)(BNHS)第8页怎样减小空间位阻怎样减小空间位阻长臂活化生物素长臂活化生物素(BCNHSBCNHS):):生物素和生物素和N-N-羟基丁二酰亚胺之间添加了两个羟基丁二酰亚胺之间添加了两个6-6-氨基已糖分子基团,形成连结臂,生物素氨基已糖分子基团,形成连结臂,生物素与大分子基团距离增加,更易发挥生
6、物素活与大分子基团距离增加,更易发挥生物素活性作用。性作用。生物素分子量小,当与抗体或酶形成生物素标识结合物后,因为大分子蛋白空间位阻效应,可对生物素与亲和素结合以及BAS应用效果造成干扰。第9页标识蛋白质醛基活化生物素标识蛋白质醛基活化生物素生物素酰肼生物素酰肼(BHZ)(BHZ):水合肼与生物素合成物水合肼与生物素合成物 主要用于标识主要用于标识偏酸性偏酸性糖蛋白糖蛋白 肼化生物胞素肼化生物胞素(BCHZ)(BCHZ):生物素与赖氨酸连接后,:生物素与赖氨酸连接后,再与无水肼反应而成。再与无水肼反应而成。除醛基外,除醛基外,BCHZBCHZ还可标识氨基还可标识氨基第10页标识蛋白质巯基活化
7、生物素标识蛋白质巯基活化生物素马来酰亚胺马来酰亚胺-丙酰丙酰-生物胞素(生物胞素(MPB)MPB):能特异地与蛋白质巯基结合活化生物素能特异地与蛋白质巯基结合活化生物素 第11页标识核酸活化生物素标识核酸活化生物素光生物素光生物素(photobiotin)(photobiotin)光敏物质光敏物质 侧链上连接侧链上连接芳香基叠氮物基团芳香基叠氮物基团,经光照后经光照后,变为芳香基硝基变为芳香基硝基苯,可直接与腺嘌呤氨基结合苯,可直接与腺嘌呤氨基结合,形成形成B-B-核酸探针,用于核酸探针,用于DNADNA或或RNARNA标识。标识。生物素脱氧核苷三磷酸(如生物素脱氧核苷三磷酸(如Bio-dUT
8、PBio-dUTP)作为作为TTPTTP结构类似物,可采取缺口移位法(结构类似物,可采取缺口移位法(DNase IDNase I和和DNADNA聚合聚合酶酶I I)掺入到双链)掺入到双链DNADNA中。中。BNHSBNHS和和BHZBHZ 可直接标识核酸,但对碱基配对有影响。可直接标识核酸,但对碱基配对有影响。当前惯用光生物素和生物素化当前惯用光生物素和生物素化dUTPdUTP作为标识核酸活化生物素。作为标识核酸活化生物素。第12页特征:特征:活化生物素经过侧链与蛋白分子连接;活化生物素经过侧链与蛋白分子连接;一个蛋白分子可被多个生物素标识多价性(是一个蛋白分子可被多个生物素标识多价性(是BA
9、S多级放大多级放大作用物质基础);作用物质基础);BNHS多标识抗体和中性或偏碱性蛋白质多标识抗体和中性或偏碱性蛋白质,BHZ则多标识微酸则多标识微酸性抗原;抗原、抗体标识后活性不变;性抗原;抗原、抗体标识后活性不变;可对标识材料(如酶)标识:碱性磷酸酶标识后,活性降低;可对标识材料(如酶)标识:碱性磷酸酶标识后,活性降低;二、活化生物素标识蛋白质二、活化生物素标识蛋白质第13页注意事项:注意事项:选择活化生物素:选择活化生物素:依抗原或抗体分子所带可标识基团依抗原或抗体分子所带可标识基团 种类(氨基、醛基或巯基)以及分子酸碱性;种类(氨基、醛基或巯基)以及分子酸碱性;控制生物素:蛋白质百分比
10、控制生物素:蛋白质百分比 生物素:生物素:IgG IgG 用量比用量比(mg/mg)宜为宜为2:1,IgG2:1,IgG应用浓度应用浓度 0.50.55 5g/ml;生物素生物素1 13 3个个/Ag/Ag,3 35 5个个/Ab/Ab;使用交联臂降低空间阻力使用交联臂降低空间阻力第14页第二节第二节 亲合素、链霉亲合素理化亲合素、链霉亲合素理化性质与标识性质与标识亲合素亲合素(avidin,AV)和链霉亲合素和链霉亲合素(streptavidin,SA)是生物素天然特异性结合物。是生物素天然特异性结合物。而且,而且,二者均为二者均为大分子蛋白大分子蛋白,所以几乎全部用,所以几乎全部用于标识物
11、质均能够同亲合素(于标识物质均能够同亲合素(AV)或链酶亲合)或链酶亲合素(素(SA)结合)结合。第15页结构结构 四亚基糖蛋白四亚基糖蛋白 四肽链蛋白四肽链蛋白 无糖基无糖基PI PI 10.5 610.5 6结合位结合位 色氨酸色氨酸 色氨酸色氨酸生物素生物素 4 44 4Ka Ka 10 1015 15 10 101515活性活性 131315U 1515U 1518U18U亲合素(亲合素(亲合素(亲合素(AVAVAVAV)链霉亲合素链霉亲合素链霉亲合素链霉亲合素(SA)(SA)(SA)(SA)一、理一、理 化化 特特 性性SASA表面所带正电荷少,且不含糖基,非特异性结合表面所带正电荷
12、少,且不含糖基,非特异性结合远低于远低于AVAV,所以当前以,所以当前以SASA标识酶结合物更为惯用。标识酶结合物更为惯用。第16页二、亲合素二、亲合素/链霉亲合素标识链霉亲合素标识v可标识可标识AV/SAAV/SA物质:物质:酶、抗原或抗体、铁蛋白、酶、抗原或抗体、铁蛋白、胶体金、胶体金、125125I I、异硫氰酸荧光素(、异硫氰酸荧光素(FITCFITC)等。)等。vHRP-AV(SA)(酶标识蛋白直接标识法):酶标识蛋白直接标识法):过碘酸钠法、戊二醛法。过碘酸钠法、戊二醛法。vABC/SABC:经过与生物素化酶复合物中经过与生物素化酶复合物中 生物素结合,间接地与酶形成结合物。生物素
13、结合,间接地与酶形成结合物。AV(SA)+B-HRP/ALP ABC(avidin-biotin-peroxidase comlplex)/ABAP 第17页第三节第三节 生物素生物素-亲合素系统亲合素系统(BAS)(BAS)特点特点灵敏度高灵敏度高:生物素标识蛋白含有多价性,且标识后抗原生物素标识蛋白含有多价性,且标识后抗原/抗抗体生物活性不变,每个亲合素有四个生物素结合部位,可同时体生物活性不变,每个亲合素有四个生物素结合部位,可同时以多价形式结合到生物素化大分子衍生物和标志物上,所以,以多价形式结合到生物素化大分子衍生物和标志物上,所以,BASBAS含有多级放大作用,反应灵敏度高。含有多
14、级放大作用,反应灵敏度高。稳定性高和特异性强:稳定性高和特异性强:AV/SAAV/SA与生物素结合亲和与生物素结合亲和常数比抗原常数比抗原-抗体反应最少高抗体反应最少高1 1万倍,二者结合呈高度专一性和万倍,二者结合呈高度专一性和不可逆性,且酸、碱、变性剂、蛋白溶解酶、有机溶剂以及反不可逆性,且酸、碱、变性剂、蛋白溶解酶、有机溶剂以及反应试剂高度稀释均不影响其结合。所以,应试剂高度稀释均不影响其结合。所以,BASBAS稳定性高,特异性稳定性高,特异性强。强。第18页第三节第三节 生物素生物素-亲合素系统亲合素系统(BAS)(BAS)特点特点适用性广泛:适用性广泛:BAS多级放大作用,以及既可多
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