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解耦联蛋白2对脓毒症腹腔感染大鼠心肌细胞凋亡、氧化应激及PKR_Caspase-11蛋白的影响.pdf
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8、娟)解耦联蛋白 2 对脓毒症腹腔感染大鼠心肌细胞凋亡、氧化应激及PKR/Caspase鄄11 蛋白的影响陈群摇 李霖摇 李秀娟摇 何德剑摇 王逸君摇(郴州市第一人民医院,湖南摇 郴州摇 423000)摇 摇 也摘摇 要页摇 目的摇 探究解耦连蛋白(UCP)2 对脓毒症腹腔感染大鼠心肌细胞凋亡、氧化应激及链 RNA 依赖的蛋白激酶(PKR)/含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)鄄11 蛋白的影响。方法摇按照数字随机法将 80 只大鼠分为假手术(Sham)组、盲肠结扎穿孔术(CLP)致脓毒症模型(CLP)组、单纯腺相关病毒(AAV)组、UCP2 过表达手术(UCP2)组各 20 只。比
9、较各组 UCP2、PKR、Caspase鄄11 蛋白表达、心肌组织病理学形态变化、心肌细胞凋亡指数、丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性。结果摇 与 Sham 组相比,CLP 组、AAV 组和 UCP2 组心肌组织中 UCP2、Caspase鄄11、MDA 表达明显升高,心肌组织中 PKR 蛋白表达、SOD 活性明显减少(P0郾 05);与 CLP 和 AAV 组相比,UCP2 组心肌组织中 PKR 蛋白表达、SOD 活性得到明显升高,Caspase鄄11 蛋白 MDA 含量显著降低(P0郾 05)。Sham 组心肌仅有少数视野偶见个别凋亡细胞,CLP 组和 AAV 组细胞的凋亡
10、指数明显增加(P0郾 05);与 CLP 组相比,UCP2 组心肌细胞凋亡指数明显降低(P0郾 05)。结论摇 过表达 UCP2 可抑制脓毒症腹腔感染大鼠心肌细胞凋亡,调控体内氧化应激平衡,同时对 PKR/Caspase鄄11 蛋白有一定的调控作用,增加 PKR表达,抑制 Caspase鄄11 的表达。也关键词页摇 解耦连蛋白 2;脓毒症腹腔感染;心肌细胞凋亡;氧化应激;链 RNA 依赖的蛋白激酶(PKR)/含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)鄄11也中图分类号页摇 R631摇 也文献标识码页摇 A摇 也文章编号页摇 1005鄄9202(2023)17鄄4322鄄05;doi:10
11、郾 3969/j郾 issn郾 1005鄄9202郾 2023郾 17郾 059基金项目:郴州市第一人民医院院级项目(N2018鄄013)通信作者:李霖(1985鄄),男,硕士,主治医师,主要从事急危重症研究。第一作者:陈群(1981鄄),女,硕士,副主任医师,主要从事急诊研究。摇 摇脓毒症是感染所致的全身炎症反 应 综 合征也1页。脓毒症从本质上是对感染性因素的反应,其可由任何部位的感染引起,临床上常见于肺炎、脓肿、泌尿系统感染等也2页。脓毒症患者一般会出现心肌功能障碍,心肌功能障碍是相关的脓毒症患者死亡率增加的主要因素,其中心血管系统介导脓毒症的发生、发展也3页。目前研究认为,脓毒症心肌损
12、伤的主要机制有内毒素炎症因子诱导、线粒体功能抑制、氧化应激、微循环障碍和细胞凋亡等也4页,其中线粒体功能抑制和氧化应激损伤的作用在临床上备受关注。解耦连蛋白(UCP)2 是线粒体阴离子通道家族的一员,在心、肺和脑等组织2234中国老年学杂志 2023 年 9 月第 43 卷中广泛分布,介导多种病理生理过程也5页。有学者研究发现动脉粥样硬化的发生发展和 UCP2 有密切联系,且其介导多种病理生理过程,例如免疫应答反应、食物的摄入和多种代谢性疾病也6页。体外研究显示,UCP2 上调可以通过调控膜电位进而保护神经元,而 UCP2 基因敲除则会导致线粒体活性氧产生明显增多以致损害神经元也7页。对于心肌
13、细胞,尤其在脓毒症状态下的心肌细胞中 UCP2 的作用近年来报道较少。链 RNA 依赖的蛋白激酶(PKR)是蛋白激酶的一种,在免疫应答、心肌细胞等方面具有明显作用也8页。含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)鄄11 早期以单体形式存在,活化条件下形成二聚体和剪切体。一旦 Caspase鄄11 被剪切,其就成为对病原体刺激产生固有免疫的重要媒介也9页。有研究表明,Caspase鄄11 的激活能够导致一种特殊的细胞死亡方式,被成为细胞焦亡,细胞焦亡在脓毒症的过度免疫中扮演十分重要的 角 色也10页。目 前 还 没 有 研 究 证 实 PKR 和Caspase鄄11 在脓毒症的表达情况,因
14、此本研究对脓毒症腹腔感染大鼠模型给予 UCP2 干预,观察期对模型 大 鼠 心 肌 细 胞 凋 亡、氧 化 应 激 及 PKR/Caspase鄄11 蛋白表达的影响。1摇 材料与方法1郾 1摇 实验动物摇 80 只 SD 大鼠均从辽宁长生生物技术有限公司购买也许可证号:SCXK(辽)2010鄄0001页。清洁级,雌、雄各半,体质量180 200 g。适宜温、湿度(24 益,自由饮水摄食)的环境中对大鼠适应性喂养 7 d。1郾 2摇 试剂和仪器摇 UCP2 膜拟物(mimics)慢病毒载体、UCP2 腺相关病毒 AAV鄄UCP2(汉恒公司);PKR抗体、Caspase鄄11 抗体(美国 Abca
15、m 公司);水合氯醛(上海国药集团);组织强效裂解液 RIPA(美国Solarbio 公司);小动物呼吸机(上海玉研科学仪器有限公司);离心机(凯特实验仪器有限公司);荧光显微镜(上海通灏光电科技有限公司)。1郾 3摇 实验分组摇按照数字随机法将大鼠分为假手术(Sham)组、盲肠结扎穿孔术(CLP)致脓毒症模型(CLP)组、单纯腺相关病毒(AAV)组、UCP2 过表达手术(UCP2)组各 20 只。Sham 组行等量生理盐水替代病毒转染手术,3 w后模拟 CLP,但开腹后不进行盲肠结扎及穿孔,手术结束后还纳盲肠至原位,关腹;CLP 组行等量生理盐水替代病毒转染手术,3 w 后建立 CLP 致脓
16、毒性心肌损伤模型;AAV 组行单纯 AAV病毒心肌转染,无目的基因的表达,3 w 后建立 CLP致脓毒性心肌损伤模型;UCP2 组行 AAV鄄UCP2 病毒心肌转染,3 w 后建立 CLP 致脓毒性心肌损伤模型。1郾 4摇 心肌转染模型建立摇各组大鼠进行心肌病毒转染。麻醉大鼠后固定,暴露胸部,气管插管,链接小动物呼吸机。以心尖部为中心,做一斜行切口,依次钝性分离肌肉,于第 4、5 肋间放置小动物开胸器暴露心脏后立即注射 AAV鄄UCP2 病毒(滴度为 1伊1012滋g/ml)10 滋l,注射 6 点,共 60 滋l。撤出开胸器后,加大通气量,充分膨胀肺,将胸腔积血积气排空后缝合。观察呼吸、心跳
17、,稳定后拔管肌肉注射100 kU青霉素,连续 3 d,预防感染。3 w 后冰冻切片心肌组织,荧光显微镜下观察,并用 Western 印迹验证 UCP2 的表达水平,评价病毒转染情况。1郾 5摇脓毒症模型制备摇采用 CLP 制备脓毒症模型也11页。麻醉大鼠,仰卧位固定消毒手术部位,沿腹部正中线做一个长约 1郾 5 cm 的切口,剪开皮肤和肌层,探查腹腔并找到盲肠,避免损伤肠系膜血管。把盲肠末端 1/3 处进行结扎,用穿刺针穿刺两次形成2 个盲肠漏,轻轻挤出少许粪便。将盲肠还纳腹腔,逐层缝合腹壁切口。Sham 组不进行盲肠结扎,其他步骤同其他 3 组。术后大鼠均皮下注射 2 3 ml/kg的生理盐
18、水,分笼饲养。脓毒症成功标准:大鼠活动减少,蜷缩,嗜睡,立毛,口鼻、眼角分泌物增多。1郾 6摇 标本采集摇 术后 24 h 麻醉大鼠,开胸,取心脏血5 ml 置于离心管中,室温静置3 4 h 后见血凝块析出,离心,获得所需血清,放置于-20 益冰箱中待用。血标本获取完毕后立即取出心脏,4 益 盐酸缓冲液漂洗,取左心室置于-80 益冰箱备用。1郾 7摇Western 印迹检测心肌组织中 UCP2、PKR、Caspase鄄11 蛋白表达摇取心肌组织置于冰上,剪碎组织,加入含有蛋白酶抑制剂的组织裂解液 RIPA进行匀浆。离心 10 min 后取上清,在蛋白样品中加入缓冲液混匀,煮沸后进行电泳、转膜和
19、封闭,封闭后分别孵育兔抗 UCP2、PKR 和 Caspase鄄11 多克隆抗体和小鼠抗 茁鄄actin 抗体,4 益 摇床孵育过夜;洗涤缓冲液(TBST)室温洗涤 3 次后孵育辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔 IgG 抗体和山羊抗小鼠IgG 抗体,室温 1 h,经 TBST 洗涤、滴加化学发光试剂于曝光仪中拍摄蛋白显影条带,ImageJ 软件分析各组蛋白相对表达量。1郾 8摇 心肌组织病理形态学观察摇 取大鼠心肌组织,甲醛固定后脱水,石蜡包埋组织后切片,厚度为5 滋m,每组 3 张,切片行苏木素鄄伊红(HE)染色,显微镜下观察大鼠心肌组织病理学变化。1郾 9摇 TUNEL 法检测大鼠心
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