结肠癌患者血清外泌体miR-320的表达及其临床意义.pdf
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1、肿瘤药学 2023 年 8 月第 13 卷第 4 期Anti-tumor Pharmacy,August 2023,Vol.13,No.4结肠癌患者血清外泌体miR-320的表达及其临床意义王治帮,关道宏,谢彝忠(海南省肿瘤医院 普外科,海南 海口,570000)摘要:目的分析结肠癌患者血清外泌体miR-320的表达及其临床意义。方法选取2018年4月至2020年4月我院收治的50例结肠癌患者纳入研究,另选取50例体检健康者纳入对照组,收集两组的血清样本,采用RT-qPCR法检测血清外泌体中miR-320的表达,并分析其对结肠癌的诊断价值。结果纯化的血清样品中存在大量外泌体颗粒,其特性与其他相
2、关研究报道一致。结肠癌患者血清外泌体中miR-320的相对表达量明显低于健康对照组 (0.690.23)vs.(1.530.48),t=11.16,P0.001。血清外泌体miR-320诊断结肠癌的曲线下面积为0.871(95%CI:0.5960.925),诊断敏感度为90.73%,特异度为82.43%。结论结肠癌患者血清外泌体中miR-320表达下调,可能作为结肠癌早期诊断的评价指标。关键词:结肠癌;血清外泌体;miR-320;表达中图分类号:R375.3 文献标识码:A Expression and clinical significance of serum exosome miR-32
3、0 in patients with colon cancerWANG Zhibang,GUAN Daohong,XIE Yizhong(Hainan Cancer Hospital,Haikou,570000,Hainan,China)Abstract:Objective To analyze the expression and clinical significance of serum exosome miR-320 in patients with colon cancer.Methods A total of 50 patients with colon cancer admitt
4、ed in our hospital between April 2018 and April 2020 were included in the study,and 50 healthy patients were included in the control group.The serum samples were collected from the two groups,and the expression of miR-320 in serum exosomes was detected by RT-qPCR method,and the diagnostic value of c
5、olon cancer was analyzed.Results There were a large number of exosome particles in the purified serum samples,and its characteristics were consistent with those reported in other relevant research.The relative expression of miR-320 in serum exosomes of patients with colon cancer was significantly lo
6、wer than that of healthy controls(0.690.23)vs.(1.530.48),t=11.16,P0.05)。本研究经本院医学伦理委员会审批通过,且入组人员均知情同意。1.2方法1.2.1样本收集收集样本前,患者均未接受手术治疗或放化疗。采集两组空腹静脉血58 mL,结肠癌组于确诊当日采集,健康对照组于体检当日采集。采集的样本经离心(3 000 rmin-1 10 min)处理后,留取上层血清,置于-80 冰箱保存。1.2.2外泌体提取及鉴定采用 ExoQuick-TM 试剂盒(日本SBI公司)提取血清外泌体。提取后,将外泌体样品染色并置于JEM-2100F型
7、透射电子显微镜(日本电子株式会社)下观察颗粒形态。采用蛋白质免疫印迹法(Western blotting)检测外泌体表面的蛋白标志物,抗体包括羊抗兔二抗(深圳市安提生物科技有限公司)、CD63抗体(武汉菲恩生物科技有限公司)、CD9抗体(武汉菲恩生物科技有限公司)、Calnexin 抗体(巴傲得生物科技有限公司)及TSG101抗体(美国abcam公司)。采用Nanosight 纳米颗粒跟踪分析仪(英国马尔文仪器有限公司,型号NS300)检测外泌体颗粒浓度,稀释样品,浓度为11081109个/mL,检测阈值设为5。1.2.3血清外泌体 miR-320 检测采用 TRIzol 试剂盒(碧云天生物技
8、术有限公司)提取外泌体样品中的总RNA。逆转录反应严格按照逆转录试剂盒(碧云天生物技术有限公司)说明书操作,反应体系20 L:RNA 样品 2 L、引物 1 L、逆转录酶 1 L、5RT缓冲液4 L、GAPDH反向引物1 L、RNase 抑制剂0.5 L、dNTP混合物(10 mmolL-1)1 L、不含RNase的水9.5 L。采用实时荧光定量PCR扩增仪对miR-320进行定量检测,反应体系25 L:稀释的cDNA 2 L、引物2 L、SYBR 12.5 L、ddH2O 8.5 L。采用2Ct法计算结果,以miR-39为外参基因,血清外泌体miR-320相对表达量=2CtmiR-320-2
9、CtmiR-39。1.3统计学分析采用SPSS 21.0统计学软件进行数据分析,计量资料以均数标准差(x s)表示,采用t检验;计数资料以率(%)表示,采用2检验;采用受试者操作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC)评价血清外泌体miR-320的诊断价值,P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1血清外泌体的鉴定电子显微镜视野内可见直径约为100 nm的圆形颗粒,呈脂质双层膜囊状。Nanosight结果显示,样品中颗粒主要分布于35190 nm,且分散均匀,颗粒直径呈单峰正态分布。Western blotting结果显示,样品中外泌体
10、表面有外泌体标志蛋白表达,细胞膜标志蛋白Calnexin呈高表达(图1)。以上结果说明纯化的血清样品中存在大量外泌体颗粒。2.2血清外泌体miR-320相对表达量结肠癌组血清外泌体 miR-320相对表达量明显低于健康对照 组(0.690.23)vs.(1.530.48),t=11.16,P0.001(图2)。2.3miR-320与结肠癌患者临床特征的关系不同临床分期、不同分化程度及是否出现淋巴结转移的结肠癌患者血清中外泌体 miR-320的相对表达量比较,差异有统计学意义(P0.05)(表1)。2.4ROC曲线分析血清外泌体miR-320诊断结肠癌的 ROC 曲线下面积为 0.871(95%
11、CI:0.5960.925),诊 断 敏 感 度 为 90.73%,特 异 度 为82.43%(图3)。462肿瘤药学 2023 年 8 月第 13 卷第 4 期Anti-tumor Pharmacy,August 2023,Vol.13,No.43讨论临床上,结肠癌的早期症状较为隐匿,约75%85%的患者确诊时已错过手术治疗时机6。因此,临床应重视结肠癌的早期诊断。随着临床对结肠癌诊断标志物的深入研究,miRNA被发现与肿瘤的发生和进展有关。miRNA为一类具有高时序性、保守性、组织特异性等特征的内源性非编码RNA。既往研究报道,miR-98-5p7、miR-1458、miR-1839等多种
12、 miRNA 在结肠癌组织中表达异常。虽然miRNA可用于结肠癌的早期诊断,但目前多数研究均以结肠癌组织或细胞作为检测miRNA的样本,而样本的采集一般通过穿刺或有创手术进行,相对繁琐,因此不适用于结肠癌的普遍筛查。有资料显示,miRNA在人体血液、胸腔积液、脑脊液、尿液等体液中均有表达,其中,外周血中miRNA的表达受到临床广泛关注10。徐菲菲等11研究注:(A)电镜下外泌体颗粒形态;(B)颗粒直径分布图;(C)Western blotting检测结果。Note:(A)The shape of exosomes particles under electron microscope;(B)P
13、article diameter distribution diagram;(C)Results of Western blotting.图1血清外泌体的鉴定Fig.1Identification of serum exosomes图3ROC曲线分析Fig.3ROC curve analysis图2血清外泌体miR-320相对表达量分析Fig.2Analysis of the relative expression of miR-320 in serum exosomes表1miR-320与结肠癌患者临床特征的关系Tab.1The relationship between miR-320 an
14、d the clinical characteristics of colon cancer patients临床特征性别男女年龄50岁50岁肿瘤直径5 cm5 cm临床分期期期分化程度中低分化高分化淋巴结转移有无n212926242327321834163119血清外泌体miR-320相对表达量0.670.090.700.110.710.140.680.120.700.110.680.130.730.100.640.070.570.050.740.120.520.080.790.12t1.0250.8100.5813.3757.1119.558P0.3100.4220.5640.0010.0
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