接种两株有益菌的生物絮团净水性能及饲料化潜力.pdf
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1、doi:10.7541/2023.2023.0074接种两株有益菌的生物絮团净水性能及饲料化潜力张 波1,2 刘泳宏3 张倩倩1,2 虞 舟4 王 强4 肖恩荣1*邱东茹1 吴振斌1*(1.中国科学院水生生物研究所淡水生态与生物技术国家重点实验室,武汉 430072;2.中国科学院大学,北京 101400;3.东华理工大学水资源与环境工程学院,南昌 330013;4.中国地质大学(武汉),武汉 430072)摘要:为强化新的絮团形成菌伪杜擀氏菌YN12(Pseudoduganella eburnea YN12,YN)利用养殖尾水生成生物絮团效果,并将絮团制成饲料,探讨在胡子鲶(Claris f
2、uscus)饲养上的可行性。在生物絮团系统中,接种活性污泥(Activated sludge,AS)、伪杜擀氏菌YN12和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis,BS)并配制成7组(AS、YN、BS、AS+YN、AS+BS、YN+BS和AS+YN+BS),分析絮团形态结构差异,评估出对模拟养殖尾水氮去除效果及微生物群落结构优势的最佳组合,最终收集最佳组合絮团烘干研磨成粉末添加到商业饲料制粒,分成对照组和絮团组两组,探讨对胡子鲶的生长性能、饲料利用率、肌肉营养成分及肝脏的消化酶和免疫酶活性的影响。结果表明:YN+BS组水质净化效果稳定,总氮去除效果(89.6%)良好,氨氮、亚硝酸盐和硝
3、酸盐积累低,具有良好的絮团生成量(9.0 ml/L)及占据优势(47.5%)的反硝化菌群(包括Hydrogenophaga、Flavobacterium、Pseudoxanthomonas、Burkholderiaceae、Comamonas、Acinetobacter等)。该组絮团粉以5%比例与商业饲料混合、研磨加工制粒后用于胡子鲶养殖,发现胡子鲶生长性能包括存活率:(1000.00)%(950.00)%;增重:(2.810.35)g(2.520.52)g;体长增加(1.680.36)cm(1.510.34)cm和饲料系数550.03460.12均优于纯商业饲料的对照组,然而在淀粉酶等消化酶
4、、免疫酶包括过氧化氢酶、总超氧化物歧化物、谷胱氨酸过氧化物酶等及肌肉营养成分包括谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸和甘氨酸等鲜味氨基酸上均低于对照组。YN+BS组絮团饲料在生长性能占据优势,然而在消化能力、免疫活性及肌肉营养成分上并未表现出明显优势,需要进一步调整水平絮团添加水平以优化胡子鲶饲养效果。关键词:有益菌;水产养殖尾水;生物絮团;反硝化菌;絮团饲料;胡子鲶中图分类号:X714;S963.7 文献标识码:A 文章编号:1000-3207(2024)02-0242-11 20世纪70年代以来,高密度集约化养殖模式加大了饵料的投入,该模式下饵料中仅有11%36%的氮被鱼类利用1,冗余饵料会残留在养殖
5、水体和底泥中,影响水产品的品质,甚至影响了渔民的利益2,3。生物絮团由藻类、细菌、原生动物和真菌等组成,生物技术(Biofloc technology,BFT)可将水体中的无机有害氮源转化为滤食性鱼类摄食利用的菌体蛋白,通过原位或异位的方式与池塘养殖结合,是目前较为有效的适合高密度养殖模式的水体处理技术之一4。当养殖水体的有机碳和总氮的比例(C/N)达到(1020)1,异养菌快速生长并大量分泌胞外聚合物(Extracellular Polymeric Substances,EPS),形成具有絮凝作用的生物团聚体5,并能充分吸收转化养殖水体中的氮来改善水质质量6,7,同时异养菌在很大程度上决定着
6、絮团的结构、粒径及蛋白质和脂类等营养组分的差异8。利用生物絮团絮凝技术转化养殖尾水中的氮,以改善养殖水环境,并将回收絮团饲料化,降低饲料系数、促进鱼类生长,是一项值得尝试的高效、健康、节水养殖模式及生物修复工艺。枯草芽孢杆菌9,10作为目前生物絮团培养常见的益生菌,能有效降低生物絮凝系统构建过程中氨氮浓度、缩短生物絮凝系统启动时间、提高絮团粗蛋白含量,更加有利于为养殖对象提供蛋白源11;活性污泥中富含大量生物絮团第 48 卷 第 2 期水 生 生 物 学 报Vol.48,No.2 2024 年 2 月ACTA HYDROBIOLOGICA SINICAF e b.,2 0 2 4 收稿日期:2
7、023-05-09;修订日期:2023-05-26基金项目:国家自然科学基金(U20A2010)资助 Supported by the National Natural Science Foundation of China(U20A2010)作者简介:张波(1994),男,硕士研究生;研究方向为生物絮团及水生态修复研究。E-mail:通信作者:肖恩荣,副研究员;E-mail: 吴振斌,研究员;E-mail:*为共同通信作者The Author(s)2024.This is an open access article under the CC-BY 4.0 License(https:/cr
8、eativecommons.org/licenses/by/4.0/).所需的丝状菌和菌胶团,可用作生物絮团系统的接种物12;而伪杜擀氏菌YN12是新发现的菌胶团形成菌,该菌可以能吸收多种单糖、二糖和多糖,利用养殖水体中高浓度的铵离子合成氨基酸和蛋白质,进而形成生物絮团被鱼类滤食利用13。为探讨伪杜擀氏菌YN12作为新的絮团形成菌在水产养殖的实用性,本研究采用枯草芽孢杆菌、伪杜擀氏菌YN12以及活性污泥分成7个组合,利用模拟养殖尾水产出生物絮团,并监测评估出水质质量、絮团产出量及微生物群落优势的最佳组合,并将回收的絮团以5%的添加水平和商业混合制成鱼饲料颗粒14,探讨其对胡子鲶的生长表现、肌肉
9、营养成分及肝脏酶活性的影响,为该新菌属在生物絮团养殖的应用提供有价值的参考。1 1 材料与方法 1.11.1 试验接种菌(1)伪杜擀氏菌YN12为实验室前期培养13,挑选合适的菌落于LB液体培养基(10 g/L氯化钠,5 g/L酵母提取物和10 g/L蛋白胨)上培养。(2)BS分离自商业菌粉,以表面粗糙不透明、污白色或者微黄色的单个菌在R2A液体培养基15(胰蛋白胨0.25 g/L,酸水解酪蛋白0.5 g/L,酵母浸粉0.5 g/L,可溶性淀粉0.5 g/L,磷酸氢二钾0.3 g/L,硫酸镁0.1 g/L,丙酮酸钠0.3 g/L,蛋白胨0.25 g/L,葡萄糖0.5 g/L)上作为培养对象。(
10、3)活性污泥采集于武汉江夏污水处理厂好氧池。1.21.2 生物絮团培养实验采用6 L的透明玻璃缸(14 cm19 cm30 cm)模拟养殖水体中的絮团反应器,共14个,有效体积4 L,随机分为7组,依次为:活性污泥组(AS)、伪杜擀氏菌YN12组(YN)、枯草芽孢杆菌组(BS)、活性污泥+伪杜擀氏菌YN12组(AS+YN)、活性污泥+枯草芽孢杆菌组(AS+BS),伪杜擀氏菌YN12+枯草芽孢杆菌组(YN+BS)、活性污泥+伪杜擀氏菌YN12+枯草芽孢杆菌组(AS+YN+BS),每组两个平行。模拟养殖废水配制每升溶液中含有513 mg CH3COONa、76 mg NH4Cl、17 mg KH2
11、PO4、10 mg MgSO47H2O、10 mg CaCl2 及微量元素:640 mg C10H14N2Na2O8(EDTA)、50 mg FeSO47H2O、130 mg ZnSO4、399 mg MnCl24H2O、75 mg CuSO45H2O 和38 mgCoCl26H2O组成16。整个试验过程分为两个阶段,第一阶段为17d,每隔3d添加1次上述配方,共计3次;第二阶段为819d停止添加配方。同时全程不换水,用蒸馏水补充损失的水分。YN和BS分别在LB液体培养基、R2A液体培养基中扩大培养,单NO2NO3菌组每次添加100 L,混合组按11比例配制共计100 L,试验110d每隔3d
12、添加1次,1119d停止添加。pH维持在7.59.5,进水C/N比在(1520)1,24h连续爆气维持溶解氧(DO)5 mg/L,环境温度控制在1528。每3d测下水中各形态氮:氨氮(Ammonium nitrogen,AN)、亚硝酸盐(Nitrite-N,-N)、硝酸盐(Nitrate-N,-N)和总氮(Totalnitrogen,TN)。1.31.3 生物絮团添加饲料的制备选取水质净化、絮团产出效果最佳处理组的生物絮团,60烘箱烘干24h,然后研磨成粉末,与商业饲料以5%添加量均匀混合并使用1 mm模具造粒,然后将颗粒放在60烘箱干燥至水分低于10%,将饲料放在干燥箱备用。1.41.4 鱼
13、生长实验NO3NO2将初始平均体长和体重分别为(5.40.1)cm、(1.40.3)g的胡子鲶(Claris fuscus)随机分成4组,每个玻璃缸的放养密度为1000条/m2,玻璃缸有效体积20 L,放养2d前自来水消毒曝气,随机分成两组:絮团组和对照组。在15d的实验期间,絮团组前3d用通用饲料喂养,后12d用絮团饲料喂食,对照组全程喂养商业饲料(表 1)。每天喂食2次(9:00/17:00),投喂饲料重量为体重的3%5%饱食投喂。每次喂完后换1/3的水并清除玻璃缸中粪便和未摄食的饲料,每3d测基本的水质参数以保持所需水质稳定。在整个试验过程中,水温、pH和溶解氧分别保持在(25.01.0
14、)、7.20.2和(6.50.5)mg/L,AN、-N和-N浓度维持在(3.820.59)、(1.410.35)和(0.060.05)mg/L。1.51.5 测定方法絮团指标表征絮团形态:生物絮团先经冷表 1 商业饲料主要营养成分Tab.1 Chemical composition of commercial feed指标Index近似成分Approximatecomposition(%)指标Index近似成分Approximatecomposition(%)水分12脯氨酸2.36粗蛋白40甘氨酸2.56粗脂肪4丙氨酸2.24粗纤维12缬氨酸1.99粗灰分18异亮氨酸1.56氯化钠0.45.0
15、亮氨酸3.09赖氨酸2.44酪氨酸1.42天门冬氨酸3.83苯丙氨酸1.83苏氨酸1.92组氨酸1.11丝氨酸1.90精氨酸2.76谷氨酸7.032 期张 波等:接种两株有益菌的生物絮团净水性能及饲料化潜力243冻干燥机(SCIENTZ-10N)干燥24h后,置于5 mL离心管中,再加入2.5%戊二醛,恒温固定1h;继续置于4冰箱固定12h;随后用0.2 mol/L磷酸缓冲液冲洗3次,每次10min;然后依次用30%、50%、75%、90%、95%、100%乙醇脱水,每次10min;最后将样品放在干燥器中干燥12h,置于场发射扫描电子显微镜(Hitachi S-4800)下观察并拍照。絮团粒径
16、:取适量生物絮团样品,以激光粒度分布仪(BT-9300ST)为基础,测得生物絮团的颗粒粒径分布。絮团量(ml/L):在试验结束时,使用英霍夫锥形管取装置中1 L水样静置30min记录絮团体积。NO2NO3水质指标测试方法水质指标测试方法:温度(T)、溶解氧(Dissolved oxygen,DO)和pH等指标用多参数水质测定仪(YSI556MPS)测定,每天2次;每隔3d测定模拟反应器出水各形态的氮氨氮(AN)、亚硝酸盐氮(-N)、硝酸盐氮(-N)、总氮(TN)及COD参照国标(GB 17378.4-2007)中相应方法测量17。微生物群落分析在系统运行结束后,取各组系统中的生物絮团样品,80
17、储存,DNA提取和测序委托北京百迈客生物科技有限公司完成。生物絮体中微生物使用的引物序列为F:5-ACTCCTACGGGGAGGCAGCA-3和R:5-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-318。首先提取絮团DNA后,设计引物并在末端加上测序接头,接着利用PCR扩增并对其产物进行定量、纯化和均一化形成测序文库,然后通过高通量测序Illumina Novaseq 6000进行测序。碱基识别分析将上述测序所得的原始图像数据文件转化为原始测序序列。OTU(Operational Taxo-nomic Unit)信息以97.0%的相似度通过Usearch软件进行聚类,每个样本的群落组成均在各个水
18、平进行统计分析。其中数据预处理:主要有如下3个步骤:(1)质量过滤:首先使用 Trimmomatic v0.33软件,对测序得到的原始序列进行过滤;然后使用cutadapt1.9.1软件进行引物序列的识别与筛选,得到不包含引物序列的待分析数据;(2)双端序列拼接:使用Usearch v10软件,通过overlap对每个样品的待分析数据进行拼接,接着根据不同区域的长度范围对拼接后数据进行长度过滤;(3)去噪:使用QIIME软件进行去噪并去除嵌合体序列,得到最终有效数据。鱼成长表现在鱼饲养阶段1d和15d,对鱼进行计数,并饥饿24h后随机取8条测量体长和体重,根据以下等式计算生长和营养相关指数:存
19、活率(Survival rate,SR,%)=最终鱼数/初始鱼数100增重(Weight gain,WG,g)=平均最终体重(g)平均初始体重(g)增重率(Weight gain rate,WGR,%)=平均最终体重(g)平均初始体重(g)/平均初始体重100体长增加(Lenght gain,LG,cm)=平均最终体长(cm)平均初始体长(cm)饲料系数(Feed conversion ratio,FCR)=(投入饲料干重未摄食饲料干重)(g)/鱼净增重(g)100特定生长率(Specific growth rate,SGR,%/d)=ln平均最终体重(g)ln平均初始体重(g)100/培养天
20、数肌肉营养成分分析为了确定饲料对于胡子鲶的生理影响,随机取8条采集肝脏和肌肉于80冰箱保存。为确定肌肉的近似成分,样品在烘箱中60干燥至恒重,氨基酸参照(GB/T 18246-2019)饲料中氨基酸的测定。肝脏生化分析肝脏指标检测交于武汉赛维尔生物科技有限公司,其中-淀粉酶(-Amylase)、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,AKP)、总胆红素(Total Bilirubin,TBIL)、总蛋白(Total protein,TP)和丙氨酸氨基转移酶(Alanine transaminase,ALT)由全自动生化仪检测;总超氧化物歧化物(Superoxidedismutas
21、e,SOD)活力、丙二醛(Malonaldehyde,MDA)、谷胱氨酸过氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)和过氧化氢酶(Catalase,CAT)用相应的商业试剂盒(南京建成试剂盒)。数据分析利用Excel和DPS数据分析系统进行数据统计和分析,PowerPoint 2021和Origin 2021进行绘图。实验数据用平均值标准差(meanSD)表示,P0.05为差异性显著。2 2 结果与讨论 2.12.1 生物絮团的形成及特征生物絮团表观形态取各组生物絮团在显微镜下(图 1ag)观察形态:其均为褐色,外形不规则且表面多孔隙,聚集了丝状菌、原生动物等。原生
22、动物不仅丰富了生物絮团微生物的多样性,还能形成较长的食物链,增强了絮团的稳定性。在AS、YN、AS+YN和AS+YN+BS组中发现大量的线虫和轮虫等,可提供优质蛋白作为鱼类食物的来源19,提高了生物絮团作为饲料的营养价值。由于枯草芽孢杆菌对线虫等有很强的抑制作用20,在BS和AS+BS组几乎没有此类生物,而在AS+YN+BS组又出现了大量此类生物,可能在接种的活性污泥中带有大量的线虫,枯草芽孢杆菌在该组中并未展现出很好的抑制效果21。取YN+BS组于扫描电镜SEM下观察,絮团(图 1h和图 1i)表观结构较为复244水 生 生 物 学 报48 卷杂,出现大量的不规则孔状结构,同时存在大量的丝状
23、物和微生物。絮团大小及生成量絮团粒径大小是影响絮团成分的重要因素之一,絮团粒径(48 m)越小富含越多必需氨基酸,粒径越大(100 m)则含有更高质量的蛋白质和脂质22。此外生物絮团的大小还可能会影响生物絮团技术(BFT)的硝化过程,低粒径的絮凝物在氨氮和亚硝态氮氧化方面效率较低23,高粒径絮团可提供更大的表面积以供微生物附着,其菌群拥有更高的丰度及多样性24。在试验结束时,AS组絮团粒径低于100 m 的占比高于其余6组,可能会导致硝化作用效率下降,在Stage出现明显的AN和TN积累(图 4)。粒径(100 m)占比变化不明显。混合菌组(AS+YN、YN+BS和AS+YN+BS)在絮团量均
24、高于单菌组(AS和YN),表明混合菌能更好地利用养殖尾水中的氮产出更多的生物絮团25,从而能有效的将模拟养殖水体中的有害氮转化菌体蛋白改善水质。絮团微生物群落结构在门水平上,变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Acteroideria)、疣微NO2NO3菌门(Verrucomicrobia)和厚壁菌门(Firmicutes)作为优势菌门,它们的相对丰度占总细菌的比例依次为85.8%、93.1%、93.4%、88.3%、89.1%、97.0%和85.8%。变形菌门是水产养殖领域的常见菌26,在生物絮团的组成细菌种类中占主导地位,它可去除有机物,在反硝化处理中也起着重要作用27,在
25、AS和YN+BS组的最高相对丰度分别为79.7%和77.8%。拟杆菌门也是常见的益生菌28,可以分解蛋白质和淀粉等大分子物质29,在生物絮团的形成过程也不可或缺。拟杆菌门通常能在生物絮团系统中观察到30,它是异养菌的主要成员并且在生物絮团中比例较大31,在AS组分布最低为5.4%,而在其他6组分布为(21.64.6)%。异养菌的比例和氮去除效率、絮团量有着一定的联系,AS组拟杆菌分布少,在Stage 出现-N和-N积累(图 4),絮团量较低(图 2)。厚壁菌门在YN组最高为13.9%,而在其他几组较低为0.8%2.3%。厚壁菌门在地表淡水丰度较低32,而在废水中检测到的丰度较高33。在本研究中
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