解毒化瘀颗粒对急性肝衰竭大鼠NLRP3炎症体调控作用的实验研究.pdf
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1、医学理论与实践 年第卷第期 解毒化瘀颗粒对急性肝衰竭大鼠 炎症体调控作用的实验研究唐秋媛 张荣臻 胡振斌 王挺帅 牙程玉 吕 超 陈月桥广西中医药大学第一附属医院广西南宁市 摘要 目目的的:观察解毒化瘀颗粒对急性肝衰竭大鼠 炎症体的调控作用探索解毒化瘀颗粒治疗急性肝衰竭的作用机制 方方法法:级 大鼠 只随机分为解毒化瘀颗粒组 只、模型组 只和空白对照组 只 解毒化瘀颗粒组和模型组大鼠给予腹腔注射 /和 /制备急性肝衰竭大鼠模型空白对照组给予腹腔注射等体积生理盐水 造模前 周开始灌胃给药解毒化瘀颗粒组给予解毒化瘀颗粒灌胃模型组与空白对照组给予等体积生理盐水灌胃 于造模成功后第 天取材采集血液标本
2、及大鼠肝组织 染色观察运用 、检测肝组织中、蛋白和 表达情况运用 检测血清、表达情况 结结果果:解毒化瘀颗粒组大鼠血清、水平低于模型组差异具有统计学意义(.)与模型组对比解毒化瘀颗粒组大鼠肝组织中、蛋白及 表达量降低差异具有统计学意义(.)结结论论:解毒化瘀颗粒能够下调 炎症体、和 等相关因子的表达对急性肝衰竭具有一定的治疗作用 基金项目:广西高校中青年教师科研基础能力提升项目()广西自然科学基金项目()国家自然科学基金项目()通信作者:陈月桥关键词 急性肝衰竭 解毒化瘀颗粒 炎症体中图分类号:文献标识码:/.:.:()()()./.:(.).(.).:.急性肝衰竭()是一种在短时间内肝脏细胞
3、出现大量变性坏死及凋亡肝脏合成、解毒、排泄等功能受损甚至引起机体代谢功能紊乱而出现严重的临床综合征属临床上危重肝脏疾病之一 该病发病急骤进展迅速预后多与患者肝脏储备功能、凝血功能、肝病严重程度等多种因素相关但至今发病机制尚未完全阐明不少学者倾向于认同“二次打击学说”该学说以免疫炎症损伤为核心指出“内毒素巨噬细胞细胞因子风暴”为主要发病机制认为 等因素通过直接损伤肝脏 年第卷第期医学理论与实践细胞机体内毒素的增加从而诱导 等多种细胞因子的产生免疫炎症系统异常出现过度免疫炎症反应而对肝脏进行“二次打击”最终引发肝衰竭 改善肝脏炎症损伤是肝衰竭研究的热点和难点近年来研究发现 炎症体及其上下游因子在固
4、 有 免 疫 中 发 挥 着 重 要 作 用 可 通 过 激 活促使白介素等炎症因子进行加工、释放引起炎症反应促使肝细胞坏死 本研究通过观察解毒化瘀颗粒对肝衰竭大鼠模型 炎症体及其上下游相关因子的表达探索其治疗肝衰竭的作用机制材料与方法.实验动物 级 大鼠 只雄性 周龄体重为()购于北京斯贝福生物技术有限公司许可证号(京)饲养条件:温度 通风且湿度为 进行适应性喂养(自由进食、饮水)周.药物解毒化瘀颗粒由茵陈 大黄 白花蛇舌草 赤芍 郁金 石菖蒲 组成采用配方颗粒(江阴天江药业有限公司)由我院提供 一服药使用双蒸水 充分溶解药物药物浓度设定为./按照体重及给药浓度稀释到适宜浓度进行灌胃 半乳糖
5、、脂多糖分别购于上海麦克林生化科技有限公司、北京索莱宝科技有限公司.主要试剂和仪器 细胞裂解液(北京普利莱基因技术有限公司)蛋白定量试剂盒()()超纯 提取试剂盒()核 酸 染 料()大鼠白细胞介素()试剂盒、大鼠白细胞介素()试剂盒(江苏酶免实业有限公司)()(/)()、()(/)(/)(/)(/)()紫外分光光度仪()荧光 仪 实时伯乐生命医学产品(上海)有限公司全自动酶标仪(北京六一仪器厂)蛋白垂直电泳仪(北京市六一仪器厂)全自动化学发光图像分析系统(上海天能科技有限公司).造模与给药采用随机法将 只 级 大鼠分为模型组、空白对照组和解毒化瘀颗粒组每组 只记录各组大鼠体重采用腹腔联合注射
6、 致急性肝衰竭小鼠模型使用前用生理盐水将 稀释成 配制成的/的溶液 用无菌生理盐水稀释成 配成/的溶液过滤除菌腹腔注射 溶液(溶液/溶液/)一次成膜 造模前 周按分组给药:空白对照组:.氯化钠注射液(灌胃).氯化钠注射液(注射)模型组:.氯化钠注射液(灌胃)造模药物(注射)解毒化瘀颗粒组:解毒化瘀颗粒药液(灌胃)造模药物(注射)每只大鼠每次灌胃体积为/每天灌胃 次(:、:)给药浓度./造模后 进行取样用 戊巴比妥钠麻醉大鼠腹主动脉采血收集血清进行 检测剖取肝脏用 洗净滤纸吸干称重后分别予 甲醛液固定及液氮保存用于病理检测、及荧光定量 检测.病理检测取大鼠肝组织包埋切片烤片脱蜡水化 苏木精水溶液
7、染色 盐酸乙醇分化 返蓝 流水冲洗伊红染色 冲洗脱水封片镜检.检测大鼠肝组织中、表达提取各组大鼠肝组织总 测定总 浓度 /(浓度)./.(纯度)反转录合成 在 的 管中配制如下混合液:加入 上、下游引物各.合成 引物序列见表 预变性 变性 退火 延伸(个循环)扩增反应在 荧光定量 仪上进行采用 法计算目的基因表达量表 引物序列引物名称引物序列()产物长度()退火温度().检测肝组织中、蛋白表达提取各组大鼠肝组织总蛋白测定蛋白浓度配置 胶加入制胶板中缓慢加入至板的/的位置加入无水乙醇压胶待分离胶凝固后加入浓缩胶进行电泳 压缩蛋白 分离蛋白 将样本蛋白转移至 膜 用 转膜液 恒流转膜用 配置 的脱
8、脂牛奶封闭液封闭 洗膜用 浸泡 后弃掉重复 次 分别加入一抗:(/)(/)(/)孵育过夜 加入相应的过氧化物酶标记的二抗孵育 洗膜 次 配置发光液成像凝胶成像系统拍照分析 软件分析蛋白医学理论与实践 年第卷第期 条带灰度值.检测按照试剂盒说明设置样本孔和标准品孔分别加入待测样本及标准品各 空白孔不加 除空白孔外样本孔和标准品孔每孔加入辣根过氧化物酶()标记的检测抗体 封板膜封闭反应孔 水浴或恒温箱温育 弃去液体吸水纸拍干每孔加入洗涤液 静置 甩去洗涤液吸水纸拍干重复洗板 次每孔加入底物、各 避光孵育 每孔加入终止液 内在 波长处测定各孔的 值.统计学方法所有数据均用 统计分析两组之间定量数值比
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