卫生部标准大肠埃希菌检验方法.doc

前言本标准代替GB/T 4789.38-2023 食品卫生微生物学检查大肠杆菌计数。本标准与GB/T 4789.38-2023 相比，重要变化如下：修改了标准的中文名称；修改了培养基和试剂；将“第二法大肠杆菌VRB-MUG 平板计数法”改为“大肠埃希氏菌平板计数法（第二法）”；删除了“第三法大肠杆菌PetrifilmTM 测试片计数法”；修改了附录A。GB 4789.38-20231食品安全国家标准食品微生物学检查大肠埃希氏菌计数1 范围本标准规定了食品中大肠埃希氏菌（Escherichia coli）计数的方法。本标准合用于食品中大肠埃希氏菌的计数，其中大肠埃希氏菌平板计数法（第二法）不合用于贝类产品。2 术语和定义2.1 大肠埃希氏菌Escherichia coli大肠杆菌广泛存在于人和温血动物的肠道中，可以在44.5发酵乳糖产酸产气，IMViC（靛基质、甲基红、VP实验、柠檬酸盐）生化实验为或的革兰氏阴性杆菌。以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生状况，推断食品中肠道致病菌污染的也许性。2.2 最也许数基于泊松分布的一种间接计数方法，简称为MPN。3 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：a） 恒温培养箱：36 1 ；b） 冰箱：2 5 ；c） 恒温水浴箱：44.5 0.2 ；d） 天平：感量为0.1 g；c） 均质器；d） 振荡器；e） 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头；f） 无菌锥形瓶：容量500 mL；g） 无菌培养皿：直径90 mm；h） pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸；i） 菌落计数器；j） 紫外灯：波长360 nm366 nm，功率6 W。4 培养基和试剂4.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤：见附录A 中A.1。4.2 EC 肉汤（E.coli broth）：见附录A 中A.2。4.3 蛋白胨水：见附录A 中A.3。GB 4789.38-202324.4 缓冲葡萄糖蛋白胨水甲基红(MR)和V-P 实验用：见附录A 中A.4。4.5 西蒙氏柠檬酸盐培养基：见附录A 中A.5。4.6 磷酸盐缓冲液：见附录A 中A.6。4.7 伊红美蓝（EMB）琼脂：见附录A 中A.7。4.8 营养琼脂斜面：见附录A 中A.8。4.9 结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）：见附录A 中A.9。4.10 结晶紫中性红胆盐-4-甲基伞形酮-D-葡萄糖苷琼脂（VRBA-MUG）：见附录A 中A.10。4.11 革兰氏染色液：见附录A 中A.11。4.12 Kovacs 靛基质试剂：见附录A 中A.12。4.13 无菌1 mol/L NaOH：见附录A 中A.13。4.14 无菌1 mol/L HCl：见附录A 中A.14。GB 4789.38-202335 大肠埃希氏菌MPN 计数（第一法）5.1 检查程序大肠埃希氏菌MPN计数的检查程序见图1。图1 大肠埃希氏菌MPN计数法检查程序不产气361 18h24h361 18h24h361 48h2h44.50.2 48 h2 h检样25g（mL）样品+ 225ml 稀释液，均质10 倍系列稀释选择适宜3 个连续稀释度的样品匀液，接种LST 肉汤管产气EC 肉汤不产气产气EMB 平板划线可疑菌落移种营养琼脂斜面或平板IMViC 生化实验，革兰氏染色阴性管阳性管查MPN 表报告GB 4789.38-202345.2 操作环节5.2.1 样品的稀释5.2.1.1 固体和半固体样品：称取25 g 样品，放入盛有225 mL 磷酸盐缓冲液的无菌均质杯内，8 000r/min10 000 r/min 均质1 min2 min，制成1:10 样品匀液，或放入盛有225 mL 磷酸盐缓冲液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min2 min 制成1:10 的样品匀液。5.2.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25 mL 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充足混匀，制成1:10 的样品匀液。5.2.1.3 样品匀液的pH 值应在6.57.5 之间，必要时分别用1 mol/L NaOH 或1 mol/L HCl 调节。5.2.1.4 用1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液1 mL，沿管壁缓缓注入9 mL 磷酸盐缓冲液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1 支1 mL 无菌吸管或吸头反复吹打，使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液。5.2.1.5 根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成10倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次，换用1支1 mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15 min。5.2.2 初发酵实验每个样品，选择3 个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3 管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1 mL（如接种量超过1 mL，则用双料LST 肉汤），36 1培养24 h2 h，观测小倒管内是否有气泡产生，24 h2 h 产气者进行复发酵实验，如未产气则继续培养48 h2 h。产气者进行复发酵实验。如所有LST 肉汤管均未产气，即可报告大肠埃希氏菌MPN 结果。5.2.3 复发酵实验用接种环从产气的LST 肉汤管中分别取培养物1 环，移种于已提前预温至45 的EC 肉汤管中，放入带盖的44.5 0.2 水浴箱内。水浴的水面应高于肉汤培养基液面，培养24 h2 h，检查小倒管内是否有气泡产生，如未有产气则继续培养至48 h2 h。记录在24 h 和48 h 内产气的EC 肉汤管数。如所有EC肉汤管均未产气，即可报告大肠埃希氏菌MPN 结果；如有产气者，则进行EMB 平板分离培养。5.2.4 伊红美蓝平板分离培养轻轻振摇各产气管，用接种环取培养物分别划线接种于EMB 平板，36 1 培养18 h24 h。观测平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。5.2.5 营养琼脂斜面或平板培养从每个平板上挑5 个典型菌落，如无典型菌落则挑取可疑菌落。用接种针接触菌落中心部位，移种到营养琼脂斜面或平板上，36 1 ，培养18 h24 h。取培养物进行革兰氏染色和生化实验。5.2.6 鉴定取培养物进行靛基质实验、MR-VP 实验和柠檬酸盐运用实验。大肠埃希氏菌与非大肠埃希氏菌的生化鉴别见表1。GB 4789.38-20235表1 大肠埃希氏菌与非大肠埃希氏菌的生化鉴别靛基质（I） 甲基红（MR） VP实验（VP） 柠檬酸盐（C） 鉴定（型别）典型大肠埃希氏菌非典型大肠埃希氏菌典型中间型非典型中间型典型产气肠杆菌非典型产气肠杆菌注1：如出现表1以外的生化反映类型，表白培养物也许不纯，应重新划线分离，必要时做反复实验。注2：生化实验也可以选用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统等方法，按照产品说明书进行操作。5.3 大肠埃希氏菌MPN 计数的报告大肠埃希氏菌为革兰氏阴性无芽胞杆菌，发酵乳糖、产酸、产气，IMViC 生化实验为或。只要有1 个菌落鉴定为大肠埃希氏菌，其所代表的LST 肉汤管即为大肠埃希氏菌阳性。依据LST肉汤阳性管数查MPN 表（见附录B），报告每g（mL）样品中大肠埃希氏菌MPN 值。6 大肠埃希氏菌平板计数法（第二法）6.1 检查程序大肠埃希氏菌平板计数法的检查程序见图2。图2 大肠埃希氏菌平板计数法检查程序6.2 操作环节6.2.1 样品的稀释按5.2.1进行。6.2.2 平板计数检样25g（ml）样品+225ml 稀释液，均质选择2 个3 个适宜连续稀释度的样品匀液，接种VRBA-MUG 平板10 倍系列稀释紫外灯照射，计数发荧光菌落报告结果36 1 18 h24 hGB 4789.38-202366.2.2.1 选取2 个3 个适宜的连续稀释度的样品匀液，每个稀释度接种2 个无菌平皿，每皿1 mL。同时取1 mL 稀释液加入无菌平皿做空白对照。6.2.2.2 将10 mL15 mL 冷至45 0.5 的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样品匀液充足混匀。待琼脂凝固后，再加3 mL4 mL VRBA-MUG覆盖平板表层。凝固后翻转平板，36 1 培养18 h24 h。6.3 平板菌落数的选择选择菌落数在10 CFU100 CFU之间的平板，暗室中360 nm366 nm 波长紫外灯照射下，计数平板上发浅蓝色荧光的菌落。检查时用已知MUG阳性菌株（如大肠埃希氏菌ATCC 25922）和产气肠杆菌（如ATCC 13048）做阳性和阴性对照。6.4 大肠埃希氏菌平板计数的报告两个平板上发荧光菌落数的平均数乘以稀释倍数，报告每g（mL）样品中大肠埃希氏菌数，以CFU/g (mL)表达。若所有稀释度（涉及液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数报告。_