ChIP操作步骤.doc
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1、ChIP实验步骤第一部分、细胞的甲醛交联与超声破碎1. 交联前的准备工作(1)细胞准备:对细胞进行一定条件的处理,以确保目的基因的转录激活。细胞密度应达到1106细胞/10 cm培养皿。(2)配制1甲醛溶液:270 l 37%甲醛加入10 ml无血清细胞培养液中即可,应使用高质量的甲醛。2. 交联与超声破碎优化超声条件,以保证目的细胞的染色质DNA能被剪切为200 bp1000 bp的片段,具体操作如下(以HepG2细胞为例):(1)小心吸出细胞培养液,加入1甲醛溶液10 ml,37孵育10 min,然后置冰上5 min终止固定。(2)小心尽量吸净培养液,用预冷的PBS 3 ml洗细胞两次。(
2、3)加入预冷的内含PMSF(10ul)的PBS 1 ml。刮取细胞并移至离心管中,于4以1200 rpm(约3000 g)离心5 min,小心移走上清液,得到细胞沉淀(细胞沉淀可于-80保存数月)(4)以200l SDS裂解缓冲液重悬细胞(含PMSF:2ul),冰上放置10 min(5)冰上超声剪切染色质DNA,使其成为200 bp1000 bp的片段(10个脉冲,每个20 s,脉冲间隔20 s)(6)加入5M Nacl 8 l,65,4h至过夜,以解交联(7)琼脂糖凝胶电泳观察剪切效果(所获超声剪切物可于-80保存数月)。第二部分、免疫共沉淀如果超声条件优化已经优化好,在步骤“(一).2(5
3、)”后,进行下列步骤。对于阴性对照,采用下述步骤“5”所述。接上述2(6)1. 4 ,13,000rpm离心10min,转移上清至2ml离心管中。2. 以含蛋白酶抑制剂的CHiP稀释缓冲液1800l,稀释200l的上清至2ml。3. 为了去除与蛋白A-琼脂糖非特异结合的分子,加入75 l蛋白A/鲑鱼精DNA琼脂, 4旋转孵育30 min。4. 4, 以1000 rpm离心1 min以沉淀琼脂,将上清转移至新的离心管中。并从这2ml中取出20l作为“input DNA”对照。5. 将上清分为两份,一份加入针对DNA结合蛋白的特异性抗体2g,另一份加强如抗体阴性对照(IgG)2g,4旋转孵育过夜(
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