酵母菌感受态制作及转化.doc
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1、Y187 酵母感受态制作及转化1)挑新鲜单菌落 Y187 于 8 ml YPDA 培养液, 30,250 rpm 培养 16-18h;2)至 OD6001.5,1:10 转接,此时 OD6000.3;3)30,250 rpm,4-7 h,每 2 h 检测一次,直到 OD600=0.4-0.6;4)转入 2 个 50 ml 离心管,5100 rpm,5 min,弃上清;5)加入 1/2 V ddH2O,洗涤细胞,5100 rpm,5min,弃上清;6)每管中分别加 1 ml 1TE/LiAc,冰上混匀,10000 rpm,15 s,去上清;7)每管中分别加 0.5 ml 1TE/LiAc,冰上混
2、匀,10000 rpm,15 s,去上清;8)每管中分别加 0.5 ml 1TE/LiAc,冰上混匀,10000 rpm,15 s,去上清;9)每管中分别加 0.4 ml 1TE/LiAc,每管 100 ul 分装;10)分别加入 100 ng 左右 DNA(plasmid)和 0.1 mg 鲑鱼 DNA(10 mg/ml,10 ul),移液器抽吸混匀溶液;11)分别加入 600 ul LiAc/PEG,高速混匀(10 s-1 min 内);12)30摇床恢复 30 min;13)超净台(无菌条件下)加入 70 ul DMSO,轻轻颠倒混匀;14)42热激 15 min;15)冰上放置 1-2 min;16)14 000 rpm,15 s,去上清;17)300 ul TE 重悬细胞;18)100 ul/1 ul 分别涂布于 YPDA 平板; 100 ul/1 ul 分别涂布于 SD/-Trp 单缺陷平板; 100 ul/1 ul 分别涂布于 SD/ -Trp/ -His 双缺陷平板上,30倒置培养 48-72 h 可见转化菌落。
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