生物传感器省公共课一等奖全国赛课获奖课件.pptx

生物传感器生物传感器第1页n是一门由生物、化学、物理、医学、电子技术等各种学科相互渗透成长起来高新技术。n应用领域：环境监测、食品分析、生物医学转换器转换器敏感元件敏感元件待测物待测物第2页第3页n开端于20世纪60年代。n1962年克拉克等人报道了用葡萄糖氧化酶与氧电极组合检测葡萄糖结果,最早提出了生物传感器(酶传感器)原理。n1967年实现了酶固定化技术,研制成功酶电极,这被认为是世界上第一个生物传感器n20世纪70年代中期，生物传感器技术成功主要集中在对生物活性物质探索、活性物质固定化技术、生物电信息转换以及生物传感器等研究，如Divies首先提出用固定化细胞与氧电极配合，组成对醇类进行检测所谓“微生物电极”。n1977年，钤木周一等发表了关于对生化需氧量(BOD)进行快速测定微生物传感器汇报，并在微生物传感器对发酵过程控制等方面作了详细报导，正式提出了对生物传感器命名。第4页生物传感器生物传感器(biosensor)biosensor)是利用一些生物活性物质所含有是利用一些生物活性物质所含有高度选择性来识别待测化学物质一类传感器。高度选择性来识别待测化学物质一类传感器。n生物传感器通常是指由一个生物敏感部件和转化器紧密结合，对特定种类化学物质或生物活性物质含有选择性和可逆响应分析装置。n它是对物质在分子水平上进行快速和微量分析方法。第5页1.原理n生物传感器结构普通是在基础传感器(如电化学装置）上再耦合一个生物敏感膜（称为感受器或敏感元件）。生物敏感膜紧贴在探头表面上，再用一个半渗透膜与被测溶液隔开。当待测溶液中成份透过半透膜有选择地附着于敏感物质上时，形成复合体，随之进行生化和电化学反应，产生普通电化学装置能感知O2、H2、NH4+、CO2等或光声等信号，并经过信号转换元件转换为电信号。第6页第7页生物敏感膜n利用生物体内含有特殊功效物质制成膜与被测物质接触时伴有物理、化学改变生化反应能够进行分子识别。n生物敏感膜是生物传感器关键元件，它直接决定着传感器功效与质量。第8页第9页信号转换器n信号转换器是将分子识别元件进行识别时所产生化学或物理改变转换成可用信号装置。生物传感器信号转换器已经有许各种，其中到当前为止用得最多且比较成熟是电化学电极，用它组成生物传感器称为电化学生物传感器。第10页将化学改变转变成电信号以酶传感器为例，酶催化特定底物发生反应，从而使特定生成物量有所增减。用能把这类物质量改变转换为电信号装置和固定化酶耦合，即组成酶传感器。惯用转换装置有氧电极、过氧化氢电极。第11页将热改变转换成电信号n固定化生物材料与对应被测物作用时常伴有热改变。比如大多数酶反应热焓改变量在25-100kJ/mol范围。这类生物传感器工作原理是把反应热效应借热敏电阻转换为阻值改变,后者经过有放大器电桥输入到统计仪中。第12页将光信号转变为电信号比如，过氧化氢酶能催化过氧化氢/鲁米诺体系发光，所以如设法将过氧化氢酶膜附着在光纤或光敏二极管前端，再和光电流测定装置相连,即可测定过氧化氢含量。还有很多细菌能与特定底物发生反应，产生荧光，也能够用这种方法测定底物浓度。第13页2.生物传感器特点n操作简单，需用样品少，能在短时间内完成测定。n普通不需进行样品预处理，它利用本身具备优异选择性把样品中被测组分分离和检测统一为一体，测定时普通不需另加其它试剂,使测定过程简便快速，轻易实现自动分析。n可进入生物体内，进行活体分析。n对被检测物质含有极好选择性，噪音低。n经固定化处理后，可保持长久生物活性，传感器可重复使用。n传感器连同测定仪成本远低于大型分析仪，因而便于推广普及。主要缺点是寿命较短。第14页3.生物传感器分类n依据传感器输出信号产生方式输出信号产生方式,可分为生物亲合型生物传感器、代谢型或催化型生物传感器。n依据生物传感器中生物分子识别元件上敏感材料生物分子识别元件上敏感材料可分为酶传感器、微生物传感器、免疫传感器、组织传感器、基因传感器、细胞及细胞器传感器。n依据生物传感器信号转换器信号转换器可分为电化学生物传感器、半导体生物传感器、测热型生物传感器、测光型生物传感器、测声型生物传感器等。第15页生物亲合型传感器生物亲合型传感器 被测物质与分子识别元件上敏感物质含有生物亲合作用，即二者能特异地相结合，同时引发敏感材料分子结构和/或固定介质发生改变，如电荷、温度、光学性质等改变。反应式可表示为：S（底物）（底物）+R（受体）（受体）=SR第16页代谢型或催化型传感器代谢型或催化型传感器底物（被测物）与分子识别元件上敏感物质相作用并生成产物，信号转换器将底物消耗或产物增加转变为输出信号，这类传感器称为代谢型传感器，其反应形式可表示为：S（底物）（底物）R（受体）（受体）=SRP（生成物）（生成物）第17页第18页第19页第20页生物活性材料固定化技术n使用生物活性材料作为生物敏感膜，必须研究怎样使用生物活性材料固定在载体（或称基质）上，这种结合技术称为固定化技术。在研制传感器时，关键是把生物活性材料与载体固定化成为生物敏感膜。n固定化生物敏感膜应该含有特点：对被测物质选择性好、专一性好性能稳定能够重复使用，长久保持其生理活性使用方便第21页惯用载体：丙烯酰胺聚合物、甲基丙烯系聚合物等合成高分子胶原、右旋糖酐、纤维素、淀粉等天然高分子陶瓷、不锈钢、玻璃等无机物惯用固定化方法：n夹心法、吸附法、包埋法、共价连接法、交联法第22页1)1)酶生物传感器酶生物传感器n酶传感器是由酶传感器和电化学器件组成。因为酶是蛋白质组成生物催化剂，能催化许多生物化学反应。酶催化效率极高，而且含有高度专一性，即能对待测生物量（底物）进行选择性催化，而且有化学放大作用。所以利用酶特征能够制造出高灵敏度、选择性好传感器。第23页第24页第25页第26页第27页葡萄糖酶传感器工作原理与检测过程当测量时，葡萄糖酶传感器插入到被测葡萄糖溶液中，因为酶催化作用而产生耗氧(过氧化氢)，其反应式为 葡萄糖氧化酶葡萄糖H2OO2 葡萄糖酸H2O2在Pt阳极上加0.6V电压，则H2O2在Pt电极上产生氧化电流为 0.6V Pt H2O2 O22H+2e-式中，2e-为形成电流电子。第28页n不一样酶传感器检测物质机理是不一样。有些酶对物质含有催化转化能力(如酪氨酸酶对酚类)，有些物质对酶活性有特异性抑制作用(如有机磷酸酯类对乙酰胆碱酯酶)或作为调整、辅助因子对酶活性进行修饰（如Mn()对辣根过氧化酶）。检测酶反应所产生信号，能够间接测定物质含量。n因为单酶传感器只能测定数目有限环境污染物，能够在一个生物传感器上偶联几个酶促反应来增加可测分析物数目。多酶传感器例子之一就是糖原磷酸化酶与一个碱性磷酸酶变旋酶葡萄糖氧化酶相结合以测定无机磷酸盐。结合各种酶之后，分析物数目就能够增加，如共固定酪氨酸酶和漆酶之后就能检测各种酚类化合物。第29页2)微生物传感器n细胞除含有各种酶外，还含有辅酶及酶促反应其它必要成份，它们存在于细胞内，直接参加酶促反应，在使用中不需纯化，亦不需添加其它成份。可直接用活细胞代替纯酶用于生物传感器。n微生物传感器分为两类：利用微生物在同化底物时消耗氧呼吸作用利用不一样微生物含有不一样酶。第30页n装置由适合微生物电极与氧电极组成。n原理：利用微生物同化作用耗氧,经过测量氧电极电流改变量来测量氧气降低许,从而到达测量底物浓度目标。n比如，荧光假单胞菌能同化葡萄糖；芸苔丝孢酵母可同化乙醇，所以可分别用来制备葡萄糖和乙醇传感器，这两种细菌在同化底物时，均消耗溶液中氧，所以可用氧电极来测定。第31页第32页n微生物反应特点微生物反应过程是利用生长微生物进行生物化学反应过程。也就是说，微生物反应是将微生物作为催化剂进行反应。酶在微生物反应中起最基本催化作用。n微生物反应与酶促反应共同点同属生化反应，都在温和条件下进行；凡是酶能催化反应，微生物也能够催化；催化速度靠近，反应动力学模型近似。第33页3)3)免疫传感器免疫传感器n抗原：含有能够引发免疫反应物质;抗体：由抗原刺激机体产生特异性免疫功效球蛋白，又称免疫球蛋白。n抗原抗体反应:选择性强,灵敏度高n免疫传感器利用抗体对对应抗原含有识别和结合双重功效，将抗体或抗原和换能器组合而成装置。n因为蛋白质分子(抗体或抗原)携带有大量电荷、发色基团等,当抗原抗体结合时,会产生电学、化学、光学等改变,经过适当传感器可检测这些参数，从而组成不一样免疫传感器。第34页n基本原理 采取抗原与抗体特异反应将待测物与酶连接，然后经过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。n在这种测定方法中有3种必要试剂：固相抗原或抗体（免疫吸附剂）酶标识抗原或抗体（标识物）酶作用底物（显色剂）第35页第36页4)生物组织传感器n生物组织传感器是以活动植物组织细胞切片作为识别元件，并与对应变换元件组成生物组织传感器。生物组织含有丰富酶类，这些酶在适宜自然环境中，能够得到相当稳定酶活性，许多组织传感器工作寿命比对应酶传感器寿命长很多；在所需要酶难以提纯时，直接利用生物组织能够得到足够高酶活性；组织识别元件制作简便，普通不需要采取固定化技术。第37页第38页第39页肝组织电极肝组织电极 动物肝组织中含有丰富H2O2酶，可与氧电极组成测定H2O2及其它过氧化物组织电极1981年Mascini等研究了数种哺乳动物和其它动物（鸟、鱼、龟）肝组织电极，报道了基于牛肝组织H2O2电极。牛肝-H2O2电极 取0.1mm厚牛肝一片，覆盖于氧电极特氟隆膜上，用“O”型橡皮圈固定，即成牛肝组织电极。在pH6.8缓冲液中，使电极与空气中氧平衡，然后加入底物，底物为浓度大于1O-5molL H2O2溶液反应产生氧气抵达氧电极特氟隆膜时，使电极输出增加在110-4mol/L底物浓度时，1.5min即可取得稳定电流。第40页 若向溶液中通以氮气，以降低氧溶解度，降低空气平衡溶液中氧残余电流（约10A）至十分之几微安，检测下限可降低至110-5molL，相关系数R=0.997 (n9)。第41页5)核酸传感器n依据生物体内核苷酸次序相对稳定,核苷酸碱基次序互补原理而设计出核酸探针传感器，即基因传感器。基因传感器普通有1030个核苷酸单链核酸分子,能够专一地与特定靶序列进行杂交从而检测出特定目标核酸分子。第42页生物传感器主要应用领域第43页（1 1）食品工业）食品工业生物传感器在食品分析中应用包含食品成份、食品添加剂、有害毒物及食品鲜度等测定分析。n食品成份分析：在食品工业中，葡萄糖含量是衡量水果成熟度和贮藏寿命一个主要指标。已开发酶电极型生物传感器可用来分析白酒、苹果汁、果酱和蜂蜜中葡萄糖等。n食品添加剂分析：亚硫酸盐通惯用作食品工业漂白剂和防腐剂，采取亚硫酸盐氧化酶为敏感材料制成电流型二氧化硫酶电极可用于测定食品中亚硫酸含量。第44页第45页第46页第47页第48页（2 2）环境监测）环境监测n大气环境监测：二氧化硫是酸雨酸雾形成主要原因，传统检测方法很复杂。将亚细胞类脂类固定在醋酸纤维膜上，和氧电极制成安培型生物传感器，可对酸雨酸雾样品溶液进行检测。第49页硫化物测定n硫化物测定是用从硫铁矿附近酸性土壤中分离筛选得到专性、自养、好氧性氧化硫硫杆菌制成微生物传感器。在pH=2.5、31时一周测量200余次，活性保持不变，两周后活性降低20%。传感器寿命为7天，其设备简单，成本低，操作方便。第50页n乙酰胆碱在乙酰胆碱酯酶催化下能够分解为乙酸和胆乙酰胆碱在乙酰胆碱酯酶催化下能够分解为乙酸和胆碱：碱：CH3COO(CH2)2N+(CH3)3Cl-+H2OCH3OOH+HO（CH2）2N+(CH3)3Cl-n在水溶液中，乙酸电离，从而使溶液在水溶液中，乙酸电离，从而使溶液pH值发生改变：值发生改变：CH3COOHCH3COO-+H+n有机磷农药或氨基甲酸酯类农药能够有效地结合到乙有机磷农药或氨基甲酸酯类农药能够有效地结合到乙酰胆碱酯酶活性位点上，抑制酶活性，降低酰胆碱酯酶活性位点上，抑制酶活性，降低pHpH值改变。值改变。经过检测这种微小改变，便能够测得溶液中有机磷农经过检测这种微小改变，便能够测得溶液中有机磷农药含量。药含量。第51页阴离子表面活性剂传感器n生活污水中烷基苯磺酸(LAS)这类阴离子表面活性剂比较多，它们自然降解性差，在水面产生不易消失泡沫，并消耗溶解氧，甚至能改变污水处理装置中活性污泥微生物生态系统。用LAS降解细菌制成生物传感器，利用当LAS存在时，LAS降解菌呼吸作用增强，引发溶解氧改变，从而造成氧电极电流改变来测定LAS浓度。第52页德国研发环境废水德国研发环境废水BODBOD分析仪分析仪第53页BOD测定n传统稀释法：在(20土1)培养5d，分别测定样品培养前后溶解氧，二者之差即为5d生化需氧量B0D。n这种方法操作繁杂，重现性差，不能及时反应水质情况和反馈信息，不适合现场监测。n生物传感器测BOD只包括到初始氧化速率，二者之间相关性能够经过对标准溶液测定来取得。这就能够将测定时间缩短到15 min左右，且重现性提升。第54页原理 将微生物电极浸入空气饱和磷酸盐缓冲液，因为固定在电极上微生物内呼吸作用，电流响应值稍有下降（图中曲线A段）；将样品S（葡萄糖-谷氨酸标准溶液或实际废水样品）加入到缓冲溶液中，因为固定化微生物耗氧降解溶液中有机物，消耗了溶解氧，电极电流响应值急剧下降(图中曲线B段）直至到达稳态(图中曲线C段)；当用磷酸盐样品溶液替换样品溶液后，电极电流响应为D。微生物传感器在曲线平台A和C间电极电流响应差值用于计算BOD值。用于BOD微生物传感器微生物有假单胞菌、异常江逊酵母、活性淤泥菌、丝孢酵母菌、枯草芽孢杆菌等。第55页甲烷传感器n在空气中甲烷含量在5-14之间时会含有爆炸性。从自然界中分离并纯培养甲烷氧化细菌，如鞭毛甲基单胞菌利用甲烷作为惟一碳源进行呼吸。将鞭毛甲基单胞菌用琼脂固定在醋酸纤维膜上，制备出固定化微生物传感器（每个反应器固定有300mg细胞）。当含有甲烷气体传输到固定化细菌池时，甲烷被微生物吸收同时微生物耗氧，使反应池中溶解氧浓度降低，电流下降，当微生物消耗氧和氧从样品气体到固定化细菌扩散之间到达平鵆时，电流下降到达平鵆，稳态电流大小取决于甲烷浓度。当空气经过反应池时，传感器电流在1min内恢复至初始状态。第56页硝酸盐微生物传感器 n硝基芳香族化合物类污染物（硝基酚、苦味酸、三硝硝基芳香族化合物类污染物（硝基酚、苦味酸、三硝基甲苯等）经微生物降解主要产物之一是亚硝酸盐。基甲苯等）经微生物降解主要产物之一是亚硝酸盐。因为因为Nitrobacter Nitrobacter sp.sp.含有亚硝酸氧化还原酶，在兼含有亚硝酸氧化还原酶，在兼性培养过程中对亚硝酸盐含有很高选择性和灵敏度，性培养过程中对亚硝酸盐含有很高选择性和灵敏度，可用于构建硝酸盐微生物传感器。可用于构建硝酸盐微生物传感器。nLarsenLarsen等发展了测定硝酸盐微型微生物传感器。他们等发展了测定硝酸盐微型微生物传感器。他们将假单胞菌将假单胞菌PseudomonasPseudomonas固定在毛细管中，置于固定在毛细管中，置于N N2 2O O微微小电化学传感器前端，固定化菌将小电化学传感器前端，固定化菌将NONO3 3-转化为转化为N N2 2O O，随，随即即N N2 2O O在传感器探头部位银阴极表面还原。该传感器对在传感器探头部位银阴极表面还原。该传感器对1010400400 mol/Lmol/L范围范围NONO3 3-浓度响应呈线性关系，介质浓度响应呈线性关系，介质中呈涡流或静止状态对结果影响不大，唯一干扰是中呈涡流或静止状态对结果影响不大，唯一干扰是NONO2 2-和和N N2 2O O，高浓度硫化物会使传感器永久失活。，高浓度硫化物会使传感器永久失活。第57页（3 3）发酵工业）发酵工业n微生物传感器含有成本低、设备简单、不受发酵液混浊程度限制、能消除发酵过程中干扰物质干扰等特点。所以，在发酵工业中广泛地采取微生物传感器作为一个有效测量工具。n微生物传感器可用于原材料如糖蜜、乙酸等测定，代谢产物如头孢霉素、谷氨酸、甲酸、甲烷、醇类、青霉素、乳酸等测定。测量原理基本上都是用适合微生物电极与氧电极组成，利用微生物同化作用耗氧，经过测量氧电极电流改变量来测量氧气降低许，从而到达测量底物浓度目标。第58页第59页发酵中葡萄糖测定发酵中葡萄糖测定n过去用操作繁琐时间长还原糖方法只能近似地预计葡萄糖改变。现在提供了快速而准确固定化酶测定方法，发酵中可依据糖消耗确定微生物生长速率，观察是否染菌，随时与产物产生一起估算转化率，确定补料效果和及时判断发酵结束时间。发酵过程或设备异常现象经过葡萄糖分析得到及时预报。n在发酵控制方面，一直需要直接测定细胞数目标简单而连续方法。人们发觉在阳极表面，细菌能够直接被氧化并产生电流。这种电化学系统已应用于细胞数目标测定，其结果与传统菌斑计数法测细胞数是相同。第60页（4 4）医学领域）医学领域第61页手掌型葡萄糖手掌型葡萄糖(glucose)glucose)分析仪分析仪第62页一个葡萄糖传感器-GlucowatchGlucose pulled through the skin by charged molecules The ions migrate to the anode(+)and cathode(-)Glucose reacts with glucose oxidase to form hydrogen peroxideThe reaction produces an electrochemical measured by the AutoSensor第63页乙醇生物传感器乙醇生物传感器n在乙醇氧化酶、水和氧存在情况下，乙在乙醇氧化酶、水和氧存在情况下，乙醇被氧化成乙醛和过氧化氢反应过程以醇被氧化成乙醛和过氧化氢反应过程以下：下：n由固定化酶膜和过氧化氢电极能够组合由固定化酶膜和过氧化氢电极能够组合组成乙醇生物传感器。组成乙醇生物传感器。第64页6)生物芯片生物芯片 生物芯片是生物传感器阵列和集成化。生物芯片是指包被在硅片、尼龙膜等固相支持物上高密度组织、细胞、蛋白质、核酸、糖类以及其它生物组分微点阵。芯片与标识样品进行杂交，经过检测杂交信号即可实现对生物样品分析。第65页第66页第67页生物芯片与普通分子杂交比较生物芯片生物芯片Southern等等信息通量信息通量高，几千高，几千-几十万点几十万点/cm2低低自动化程度自动化程度 高高低低n研究速度快快慢慢n试验结果平行性好好低低第68页n基因芯片是含有相当集成度（通常每平方厘米点阵密度高于400）核酸探针阵列，经过将大量寡核苷酸片断或已知基因片段有序地固定于固相支持物上用作核酸探针，然后与标识样品分子杂交，便可依据碱基互补匹配原理，以及各位点探针分子杂交信号强度来确定样品分子数量和序列信息。n基因芯片可同时对大量核酸分子进行检测分析，已应用于生物医学、生物分子学、人类基因组研究和医学临床诊疗领域。（1）基因芯片）基因芯片第69页第70页光刻技术在基因芯片制备过程中，使用了半导体领域微加工技术（如光刻技术）。第71页第72页基因芯片分析普通流程基因芯片分析普通流程 大量探针分子固定于支持物上后，利用DNA双链互补碱基之间氢键作用，与标识样品分子进行杂交，然后用精密扫描仪或摄像纪录，经过计算机软件分析处理，得到有价值生物信息。待测核酸样品制备（与扩增）；荧光素标识待测核酸样品；与芯片进行杂交；洗涤去除未杂交标识样品；采集芯片杂交模式（用荧光显微镜或荧光扫描仪或激光共聚焦扫描仪）；对芯片杂交模式进行电脑分析获取待测样本相关信息。第73页试样处理试样处理点阵固定点阵固定反应或杂交反应或杂交芯片制作芯片制作标识标识洗涤检测扫描检测扫描光刻合成光刻合成微量点样微量点样喷墨喷墨纯化、标识纯化、标识光化学检测光化学检测电化学检测电化学检测计算处理计算处理第74页第75页基因芯片点样仪Macroarray芯片数据处理芯片数据处理第76页芯片反应与杂交芯片反应与杂交依据碱基互补配对原剪发展核酸链间分子杂交技术，在靶标样品与探针之间进行选择性反应，将反应一方(探针)固定在芯片上，另一方(荧光标识)经过流路加至芯片上。第77页杂交信号检测杂交信号检测n对于用荧光素标识经扩增（也可用其它放大技术）序列或样品，与芯片上探针进行杂交，然后冲洗，采集荧光图像。n1.激光激发使含荧光标识DNA片段发射荧光。2.激光扫描仪或激光共聚焦显微镜采集各杂交点信号。3.软件进行进行图象分析和数据处理。第78页基因芯片基因芯片荧光标识样品荧光标识样品共聚焦共聚共聚焦共聚共聚焦显微镜共聚焦显微镜获取荧获取荧光获取荧获取荧光图图获取荧光图象获取荧光图象杂交结果分杂交结果分析析探探 针针 设设 计计杂交杂交第79页（2）蛋白质芯片）蛋白质芯片 蛋白质芯片主要是蛋白质如抗原或抗体在载体上有序排列，依据蛋白质 分子、蛋白质与核酸相互作用原理进行杂交、检测和分析。第80页第81页（3）组织芯片）组织芯片 它将数十个甚至上千个不一样个体组织标本集成在一张固相载体上，为医学分子生物学提供了一个高通量、大样本以及快速分子水平分析工具。第82页芯片上试验室芯片上试验室n将生命科学研究中许多不连续分析过程如样品制备、生物化学反应和目标基因分离检测等烦琐试验操作，经过采取象集成电路制作中半导体光刻加工那样缩微技术，移植到芯片上进行，使其连续化、微型化。第83页第84页生物传感器发展方向n集成化与功效化n提升灵敏度n智能化第85页