QDPR通过调控Beclin1改善UUO诱导的大鼠肾间质纤维化.pdf
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1、806安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y;58(5)网络出版时间:2023-04-21 11:21:19 网络出版地址:h t t ps:/k n s.c n k i.n et/k c ms/d et a il/34.1065.R.20230420.1340.017.h t mlQDPR通过调控Beclinl改善UUO诱导的大鼠肾间质纤维化高海洋I,何海兰駕张立国I,陈 曦打李治国彳摘要目的探讨醞型二氢生物喋吟还原酶(QDP R)在单 侧输尿管梗阻(UUO)大鼠模型肾间质纤维化中的作用及对 Bec l in l的影响。
2、方法通过单侧输尿管结扎的方法构建 UUO模型,Ma sso n、COL I染色和West er n bl o t技术分析纤 维化进展及QDP R和Bec l in l的表达情况。慢病毒输尿管逆 行注射构建过表达QDP R基因和空载对照UU0模型,评估 慢病毒感染效率和QDP R表达情况,并检测QDP R过表达对 纤维化进展和Bec l in l表达的影响。结果 UUO模型组较 假手术组的胶原纤维表达水平增高(P 0.05),QDP R表达 水平降低(P 0.05),Bec l in l表达增高(P 0.05)o通过输 尿管逆行注射慢病毒,成功感染肾脏,并能增加肾脏QDP R 表达。过表达QDP
3、 R后,胶原纤维表达水平降低(P 0.05),且Bec l in l表达水平下降(P 0.05)o结论 过表达 QDP R抑制了 Bec l in l的表达水平,改善了纤维化的进展,提 示过表达QDP R可能通过抑制Bec l in l进而抑制肾间质纤维 化。关键词醞型二氢生物喋吟还原酶;Bec l in l;肾间质纤维化 中图分类号R 364.2+4文献标志码A 文章编号1000-1492(2023)05-0806-06 d o i:10.19405/j.c n k i.issn l OOO-1492.2023.05.017肾间质纤维化是许多进行性慢性肾脏疾病的共 同途径,最终导致终末期肾衰
4、竭,其发病机制十分复 杂,主要特征是细胞外基质沉积、成纤维细胞积累、炎性细胞浸润等目前缺乏有效治疗方法。因 此,探讨肾间质纤维化的发病机制,对于预防和减轻 肾间质纤维化具有重要意义。醞型二氢生物喋吟还 原酶(q u in o id d ih y d r o pt er id in e r ed u c t a se,QDP R)在体 外研究中发现有抗纤维化作用,过表达QDP R能减 少转化生长因子-pl(t r a n sf o r min g g r o w t h f a c t o r-pl,TGF-pi)的表达,提示其在肾间质纤维化中有重 要作用。据报道,QDP R这一作用可能与自噬相
5、2022-12-13 接收基金项目:河北省自然科学基金(编号:H2020209243);河北省医学 科学研究课题计划(编号=20210159)作者单位J华北理工大学附属医院泌尿外科,唐山0632102华北理工大学公共卫生学院,唐山063210作者简介:高海洋,男,主治医师;李治国,男,教授,硕士生导师,责任作者,E-ma il:l izh ig u o n est.ed u.c n关。自噬是一种高度保守的细胞行为,其在单 侧输尿管梗阻(u n il a t er a l u r et er a l o bst r u c t io n,UUO)大鼠模型肾纤维化过程中起到双重作用7T。自噬 诱导
6、肾小管萎缩和分解,从而促进纤维化,又可 能通过抑制上皮间质转化进而抑制纤维化。此 外,研究问发现Bec l in l是自噬过程的关键调节因 子之一。因此,该研究拟通过构建过表达QDP R的 UUO模型,探讨QDP R是否通过调控Bec l in l的表 达进而调控肾间质纤维化,为肾间质纤维化发病机 制的研究提供新的思路。1材料与方法1.1主要试剂慢病毒由华北理工大学李治国教 授课题组自制;QDP R抗体、o t-SMA抗体(美国P r ot ein t ec h 公司);COL I(武汉博士德生物工程有限 公司);E-Ca d h er in(ECa)抗体、Bec l in l 抗体(美国 P
7、 r o t ein t ec h公司);山羊抗兔抗体(英国Abea m公 司);枸椽酸三钠、柠檬酸(天津大茂化学试剂厂);DAB(德国Sig ma公司);Ma sso n染色试剂盒(珠海 贝索生物科技有限公司)。1.2实验动物3周龄,雄性健康清洁(SP F)级的 SD大鼠北京维通利华实验动物技术有限公司,实 验动物的生产许可证号:SYXK(京)2015-0017 24 只,体质量(237 13)g,置于北京中日友好医院医 学动物实验动物房饲养合格证号:SYXK(京)20054)019;伦理审批单位:华北理工大学;动物实验 研究的伦理审批号:LAEC-NCST-2017015。动物模 型的制备
8、:UUO模型组(U组):结扎大鼠左侧的 输尿管两端,并剪断中间的输尿管;假手术组(S 组):与UUO模型组方法相同,唯一区别是只分离 左侧输尿管,并不结扎及剪断;UUO+QDP R空 载组(C组):与UUO模型组方法相同,区别是在分 离左侧输尿管后,沿着输尿管逆行注射病毒滴度为 l.Ox 107 U过表达QDP R空载慢病毒50 pl,然后用 丝线结扎注射口的上方防止病毒流下,结扎输尿管 两端,剪断中间的输尿管;UUO+QDP R过表达组(Q组):与UUO+QDP R空载组方法相同,唯一区 别为注射的病毒是过表达QDP R的慢病毒。造模后 安徽医科大学学报 Acta Universitatis
9、 Medicinalis Anhui 2023 Ma y;58(5)807常规饲养,分别在7、14 d每组各处死3只。1.3免疫组化与Masson染色 造模7、14 d后,取 大鼠左侧肾脏做石蜡切片,然后进行免疫组化及 Ma sso n染色,最后在400倍的显微镜下观察,随机 选10个不重复的视野,用Ima g e J分析。1.4 Western blot 检测 West er n bl o t 分别检测 a-SMA、QDP R、ECa和Bec l in l的表达水平。取大鼠左 侧肾组织,液氮研磨后加入RIP A裂解液提取蛋白。Br a d f o r d法测定蛋白浓度,统一稀释到3 000|
10、x g/ml,通过SDS-P AGE电泳每组跑15 pig蛋白,半干转到 NC膜,5%牛奶室温封闭2h,抗a-SMA(1:1 000)、QDP R(l:1 000)、ECa(l:1 000),Bec l in l(1:1 000)室温孵育2 h,TBST洗膜,二抗(山羊抗 兔1:3 000)室温孵育2 h,TBST洗膜,最后显影,使 用Ima g e J分析条带的灰度值,然后计算各蛋白目的 条带与内参的比值。1.5 统计学处理 所有数据均由IBM SP SS St a t ist ic s 21进行统计分析,计量资料采用xs进行统计 学描述,两组间比较采用独立样本t检验,P 0.05 示差异有
11、统计学意义。2 结果2.1 UUO模型存在肾脏纤维化 单侧输尿管结扎 构建UU0模型(见图1),通过Ma sso n和COL I染 色以及West er n bl o t检测纤维化因子ECa和a-SMA 的表达情况。Ma sso n染色结果显示:UUO模型7 d 组(U7)中的胶原纤维高于S模型7 d组(S7)(t=-19.596,P 0.001),UUO 模型 14 d 组(U14)中的 胶原纤维高于S模型14 d组(S14)Q=-6.552,P 0.001);COL I染色显示:U7组中的COL I的含 量高于 S7 组(t=-11.351,P 0.001),U14 组中的 COL I 的
12、含量高于 S14 组(t=-4.939,P 0.01);且,与S7组比较,U7组中ECa含量降低(t=7.387,P 0.05),a-SMA 含量升高(t=-3.058,P 0.05);与S14组比较,U14组中ECa含量降低Q=7.866,P 0.01),a-SMA 含量升高&=-7.98,P 0.01)o 见图 2。2.2 UUO模型中QDPR表达 肾脏免疫组化和 West er n bl o t检测了 QDP R的表达情况。免疫组化 结果显示:与S7组比较,U7组中的QDP R表达水平 降低(227.256,P 0.001);与 S14 组比较,U14 组 中的QDP R表达水平降低(t
13、=18.499,P 0.001)。West er n bl o t 结果显示:U7 组(t=20.897,P 0.001)和 U14 组(=8.301,P 0.01)中 QDP R 含 量均低于S组。见图3。2.3过表达QDPR基因的UUO模型的构建 C7 组(慢病毒对照7 d组)和Q7组(QDP R慢病毒过表 达7 d组)中慢病毒标签ZsGr een均有表达;C14组(慢病毒对照14 d组)和Q14组(QDP R慢病毒过表 达14 d组)组中ZsGr een亦有表达,提示慢病毒感 染肾脏成功。免疫组化染色QDP R的结果显示:与 C7组比较,Q7组中QDP R的表达差异无统计学意 义(i=1
14、.105.P=0.331);而与 C14 比较,Q14 中 QDP R染色的表达面积增加(t=-34.138,P 0.001)。West er n bl o t结果显示:与C7组比较,Q7 组中QDP R的表达差异无统计学意义(t=1.022,P=0.365);与C14比较,Q14中QDP R的表达增加(/=-7.061,P 0.01)。结果提示慢病毒在输尿管 逆行注射后7 d已有表达,但未增高,14 d过表达组 中QDP R显著增高。见图4。2.4过表达QDPR对UUO诱导的大鼠肾间质纤 维化的影响 Ma sso n染色显示:与C14组比较,Q14 组的胶原纤维面积降低(t=6.811,P
15、0.01);COL I染色显示:与C14组比较,Q14组的COL I染色 面积降低(t=4.643,P 0.05);West er n bl o t 检测显 示:与C14组比较,Q14组中的ECa蛋白的表达水 平增高(t=-10.280,P 0.05),a-SMA 表达水平 降低(t=2.922,P 0.05)。见图 5。2.5 过表达QDPR对Beclinl蛋白的表达的影响 与S14比较,U14组中Bec l in l蛋白的表达水平升 高(/=-3.272,P 0.05);过表达 QDP R 后,与 C14 组比较,Q14组中Bec l in l蛋白的表达水平降低Q=10.404,P 0.0
16、01)o 见图 6。3讨论肾间质纤维化是各种终末肾病发展到终末肾功 能衰竭的终末途径卫,已成为危害人类生命健康 的公共卫生问题。深入认识肾脏纤维化的发病机 制,对肾脏疾病的预防、诊断和治疗具有重要的意 义。808安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y;58(5)AU7S14U14S7Ba-SMA(42 k u)ECa(125、100k u)Ac t in(43 k u)CDS7U7图2 Masson和COL I染色以及 Western blot检测UUO模型中的纤维化水平A:Ma sso n、COL I 染色检测胶原纤维
17、x400;B、C:West er n bl o t 检测(xSMA、ECa 表达水平;D K:Ma sso n、COL I 染色和 West er n bl o t 的统计学分析;与 S 组比较:*P 0.05,*P 0.01,*P 0.001研究T发现,QDP R在体外研究中有一定的 抗肾脏纤维化作用,可能与自噬密切相关。过表达 QDP R基因能减少在纤维化中有重要作用的TGF-P 1的表达,提示其在肾间质纤维化中发挥着重要 的作用。本课题开展了过表达QDP R对肾间质纤维 化影响的体内研究,UU0模型肾脏出现了纤维化,并且在UU0模型中发现QDP R含量降低,而与自噬 密切相Bec l i
18、n l的表达增高,提示QDP R和Bec l in l 可能在肾脏纤维化中有重要作用。为进一步研究 QDP R在肾间质纤维化中的作用和机制,本研究用 输尿管逆行注射的方法,制备过表达QDP R及其空 载对照UUO模型,探究过表达QDP R对肾间质纤维 化的影响及其可能机制。结果显示,C组与Q组中 慢病毒标签ZsGr een均有表达,提示模型制作成功。免疫组化染色和West er n bl o t检测显示QDP R在7 d 表达并未表达增加,而14 d表达明显升高,提示慢 病毒介导的基因表达需要超过1周才能充分表达。通过Ma sso n染色及检测抗纤维化相关因子ECa的 表达水平,发现过表达QD
19、P R可降低胶原纤维并增 加ECa的表达,表明过表达QDP R可以抑制UUO模安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y;58(5)809QDP RS7U7S14U14 _ W Im 1-,.-:|.inACQDP R(26 k u)Ac t in(43 k u)DE20 r1.5 rF黑B-m嘲 M d a o2010105 515151414 m mS7S74 47 7 u uo o图3免疫组化染色和Western blot检测QDPR在肾纤维化中的表达情况A:免疫组化染色检测QDP R表达情况X400;B.C:West
20、er n bl o t检测QDP R表达水平;D G:免疫组化染色和West er n bl o t的统计学分析;与 S 组比较:*P 0.01,*P 0.001C7 Q7 C14QDP RD 25 r E 2.0ZsGr een(26 k u)QDP R(26 k u)Ac t in(43 k u)G 1.5F 60 r*C7C7KBM4nwHddo1414 clcl4 4 QIQIAC图4免疫组化染色和Western blot检测QDPR模型的制备情况A:免疫组化染色检测QDP R表达情况X400;B、C:West er n bl o t检测ZsGr een.QDP R表达水平;D G:免
21、疫组化染色和West er n bl o t的统计学分析;与 C 组比较:*P 0.05 01,*P 0.001810安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y;58(5)a-SMA(42 k u)QIQI1414clECa(125、100k u)Ac t in(43 k u)bvsh14141414 clcl14141414cl1414 QIQIc Ica图5 Masson.COL I染色和Western blot检测过表达QDPR的UUO模型中的纤维化水平A:Ma sso n、C0L I染色检测胶原纤维X400;B、C:M
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