FTO及其抑制剂对DLBCL利妥昔单抗耐药的影响.pdf

760安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y；58(5)网络出版时间：2023-04-21 10：29：13 网络出版地址:h t t ps:/k n s.c n k i.n et/k c ms/d et a il/34.1065.R.20230420.1339.010.h t mlFTO及其抑制剂对DLBCL利妥昔单抗耐药的影响顾季炜,施梅駕宋国齐摘要 目的 探讨脂肪量和肥胖相关蛋白（FTO）及其抑制 剂对弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）利妥昔单抗耐药的影 响。方法 选取2种“双重打击”淋巴瘤衍生的细胞系，活 化B细胞样（ABC型）OCI-LY8（LY8）和生发中心B细胞样（GCB型）OCI-LY18（LY18），采用梯度加药法构建利妥昔单 抗耐药细胞系（LY8R、LY18R）；运用CCK-8法检测不同浓度 利妥昔单抗分别干扰亲本及耐药细胞后的细胞存活率并计 算半数抑制浓度（IC50）值;An n ex in V/P I双染法检测亲本及 耐药细胞的凋亡率;RT-q RCR、免疫荧光和West er n bl o t检测 在耐药细胞株中去甲基化酶FTO的表达情况;在耐药细胞 株中加入甲氯芬酸钠（MA）抑制FTO表达，用RT-q RCR和 West er n bl o t验证抑制情况，并通过West er n bl o t分析抑制耐 药株中FTO后,c-My c和CEBP A的表达情况。结果 与亲 本细胞比较，在利妥昔单抗耐药的细胞株中，去甲基化酶 FT0、c-My c表达均增加,CEBP A表达降低，差异均有统计学 意义（P 0.01）。耐药细胞株经MA处理后,FT0、c-My c表 达降低,CEBP A表达增高,差异均有统计学意义（P 0.01）。结论FT0在耐药株中表达明显增高,MA可抑制DLBCL耐 药细胞中FTO表达，可能对利妥昔单抗耐药的DLBCL患者 有治疗的潜能。关键词 弥漫大B细胞淋巴瘤;利妥昔单抗;脂肪量和肥胖 相关蛋白;c-My c中图分类号R55文献标志码A 文章编号1000-1492（2023）05-0760-06 d o i:10.19405/j.c n k i.issn io o o-1492.2023.05.010弥漫大B细胞淋巴瘤（d if f u se l a r g e B c el l l y mph o ma,DLBCL）是起源于生发中心的,是非霍奇金 淋巴瘤（n o n-h o d g k in l y mph o ma,NHL）中最常见的一 种类型。利妥昔单抗联合环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松（r it u x ima b,c y c l o ph o sph a mid e,d o x o r u bic in,v in c r ist in e,a n d pr ed n iso n e,R-CHOP）方 案大约能治愈60%的DLBCL患者,其余患者则会 出现难治或复发。因此，研究利妥昔单抗获得性 2022-12-18 接收 基金项目：国家自然科学基金（编号=81770214）作者单位J南通大学医学院，南通2260012南通大学附属医院血液科，南通226001作者简介:顾季炜，女,硕士研究生；宋国齐，男，教授，主任医师，硕士生导师，责任作者,E-ma il:sd so n g g q 163.c o m耐药的机制具有重大意义。m6A是腺昔N6位发生 甲基化，是一种转录后修饰，在癌症发生、发展及耐 药中发挥重要的作用。研究表明,MYC基因易 位相关的DLBCL与R-CHOP治疗的低生存率相 关,这表明MYC可能与DLBCL利妥昔单抗耐药存 在相关性。脂肪量和肥胖相关蛋白（f a t ma ss a n d o-besit y-a sso c ia t ed pr o t ein,FTO）是一种去甲基化 酶，在急性髓系白血病（a c u t e my el o id l eu k emia,AML）中 R-2-羟基戊二酸（R-2-h y d r o x y g l u t a r a t e,R-2HG）通过靶向FTO/m6A/MYC/CEBP A信号传导，抑制了癌细胞增殖,发挥抗肿瘤作用。甲氯芬酸 钠（mec l o f en a mic a c id,MA）可结合FTO的活性表 面，选择性抑制FTO介导的m6A去甲基化,减少胶 质母细胞瘤干细胞的增殖。该研究旨在探讨 FTO及其抑制剂MA通过MYC、CEBP A影响DLBCL 利妥昔单抗的耐药机制。1材料与方法1.1试剂与仪器RP MI-1640培养基、胎牛血清（美国Gibc o公司）；健康人血浆（南通大学附属医 院健康体检者）；SDS-P AGE凝胶配制试剂盒、CCK-8 试剂盒（日本 Do jin Do 公司）；An n ex in V-FITC/P I 双 染细胞凋亡试剂盒（江苏凯基生物技术股份有限公 司）；利妥昔单抗注射液（上海罗氏制药有限公司）；兔抗人FTO单克隆抗体（美国Sa n t a Cr u z Bio t ec hn o l o g y 公司）;兔抗人c-My c单克隆抗体、兔抗人 CEBP A单克隆抗体、兔抗人GAP DH单克隆抗体（美国Cel l Sig n a l in g Tec h n o l o g y公司）；引物由广州 市锐博生物技术有限公司设计及合成;Tr izo l试剂（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）；酶联仪（美 国Bio t ek公司）；流式细胞仪（美国BD公司）；蛋白 免疫印迹电泳设备及化学发光成像系统（美国BioRa d 公司）；Qu a n t St u d io 5荧光定量P CR仪（美国 Th er mo f ish er 公司）。1.2方法1.2.1细胞来源与培养 选取2种“双重打击”淋 巴瘤衍生的细胞系，活化B细胞样（ABC型）0CI-LY8（LY8）和生发中心B细胞样（GCB型）0CI-安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y；58(5)761LY18(LY18),均购自中国科学院细胞库上海保藏 中心。取生长状态良好的细胞系，培养于含10%胎 牛血清、1%青霉素-链霉素的RP MI-1640完全培 养基中，置于37弋、5%C()2、100%饱和湿度的培养 箱中培养，观察细胞培养基颜色及显微镜下密度,及 时换液和传代。1.2.2耐药细胞株模型的建立 采用梯度加药法 诱导DLBCL细胞系的耐药，分别将处于生长对数期 的细胞系LY8、LY18以0.5 x l O/ml的密度接种 于含10%新鲜人血浆的RP MI-1640培养基中，加入 0.5 pig/ml利妥昔单抗,12 h后换正常完全培养基 培养至细胞状态恢复正常(约4 5 d)，在下个周期 将利妥昔单抗浓度提高到前1个周期的2倍，按此 方式重复9个周期后,得到对128 jig/ml利妥昔单 抗耐药的细胞株(LY8R、LY18R)。1.2.3 CCK-8法检测细胞存活率 将亲本及耐药 细胞株分别接种于96孔细胞培养板中，每孔细胞5 X104个，分别加入浓度为0、2、10、50、100 Mg/ml利 妥昔单抗,每个平行样本3个副孔，孵育48 h后按 所提供的实验步骤在酶联仪上测450 n m波长处的 吸光度值，计算细胞存活率。将耐药细胞株及经 MA根据药物说明书MA的半数抑制浓度(h a l f ma x ima l in h ibit o r y c o n c en t r a t io n,IC50)为 5 6 x 106 mo l/L处理后的耐药细胞株分别接种于96孔细胞 培养板中，每孔细胞5 x 104个,每个平行样本3个 副孔，孵育48 h后，按实验步骤在酶联仪上测450 n m波长处的吸光度值，计算细胞存活率。1.2.4 流式细胞术检测调亡 将亲本及耐药细胞 株均分为2组：0|ig/ml和50|j,g/ml利妥昔单抗 组，每组3个复孔，于细胞培养箱内,48 h后收集细 胞，1 000 r/min 离心 5 min,P BS 洗 3 次，Bin d in g Bu f f er重悬细胞，分别加入FITC-An n ex in V和P I各5|x l,避光孵育20 min。BD流式细胞仪检测细胞凋亡 率，Fl o w jo软件进行统计分析。1.2.5 RT-q P CR 测定 FTO 表达 收集 2 x 106 3 x 106个细胞,提取总RNA,参照逆转录试剂盒说明 书合成c DNA,采用RT-q P CR检测各组FTO的表达 情况，引物序列由广州锐博生物技术有限公司设计 及合成，引物序列见表1。1.2.6 West er n bl o t检测 收集亲本及耐药细胞，提取总蛋白，并进行BCA蛋白定量分析。SDS-P AGE 电泳，随后将蛋白转至P VDF膜上，转膜结束 后用5%脱脂牛奶封闭2 h。分别加入FTO抗体(1:1 000)、c-My c抗体(1:1 000)、CEBP A抗体表1 RT-qPCR引物序列引物名称序列(50)FTO-TGCC CGA ACA TTA CCT GCT GFTO-RTGC TCC TTC TAG GGT TIT GCTGAP DH-FGGT CAC CAG GGC TGC TTT TAGAP DH-RGGA TCT CGC TCC TGG AAG ATG(1:1 000)及 GAP DH 抗体(1:1 000)4 兀孵育过 夜。TBST洗膜3次，每次10 min,结束后分别加入 HRP标记的羊抗兔Ig G二抗(1:5 000)室温避光孵 育2 h,TBST洗膜5次，ECL化学发光法显影Ima g e J测量条带灰度值。1.2.7免疫荧光检测 将亲本及耐药细胞用PBS 清洗3次,4%多聚甲醛固定15 min,P BS洗3次,0.5%Tr it o n X-100 室温透化5 min,封闭 1 h,P BS 洗 3次,4七过夜孵育荧光一抗FTO,P BS洗3次、室 温避光孵育荧光二抗2 h,DAP I染核5 min、滴加抗 淬灭液后拍照。1.3 统计学处理 采用Gr a ph pa d P r ism&0软件 进行统计分析，实验数据采用x s表示。组间比较 用t检验，以P 0.05为差异有统计意义。2 结果2.1利妥昔单抗耐药DLBCL细胞株鉴定 将亲 本及耐药细胞株分别重悬于RP MI-1640完全培养 基及含10%新鲜人血浆RP MI-1640培养基中，观察 细胞存活率。结果显示在0、2、10、50、100 jx g/ml的 利妥昔单抗作用下,LY8及LY8R细胞的IC50分别 为 0.54.47.15 iig/ml,耐药指数为 87.31；LY18 及 LY18R 细胞的 g o分别为47.90.227.0 耐药指数为4.74,差异均有统计学意义(t=68.12、7.425,均 P 0.001)。见图 1。2.2利妥昔单抗处理亲本与耐药细胞株的凋亡差 异 与对照组(0 pt g/ml利妥昔单抗组)比较,50|x g/ml利妥昔单抗组和DLBCL耐药株(LY8R、LY18R)组细胞凋亡差异均无统计学意义,而亲本细 胞株组(LY8、LY18),差异有统计学意义(P 0.001)o 见图 2。2.3 RT-qPCR检测FTO在亲本与耐药DLBCL 细胞株中的表达情况 RT-q P CR检测结果显示,FTO在耐药细胞株中表达明显升高，表明FTO可能 与DLBCL利妥昔单抗耐药存在相关性。见图3。2.4免疫荧光检测FTO蛋白在亲本与耐药DL-BCL细胞株中的表达情况免疫荧光结果显示,FTO在耐药细胞株中表达明显升高，表明FTO可能762安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y；58(5)150 LY18RLY180-1-1-1-10 2 10 50 100利妥昔单抗药物浓度(Ug/ml)图1 CCK-8法测定细胞存活率与DLBCL利妥昔单抗耐药存在相关性。见图4O2.5 Western blot 检测 FTO、c-Myc、CEBPA 蛋白 在亲本与耐药DLBCL细胞株中的表达情况 West er n bl o t检测结果显示FTO、c-My c在耐药细胞 株LY8R.LY18R中表达升高,CEBP A表达降低，由 此可见，FTO可能通过c-My c、CEBP A影响DLBCL 对利妥昔单抗的耐药。见图5。2.6 RT-qPCR检测经抑制剂MA处理后FTO在 耐药细胞株中的表达情况RT-q P CR检测结果显 示，经抑制剂MA处理后,FTO在耐药细胞株中的表 达明显降低。见图6。2.7 Western blot检测经抑制剂 MA处理后,FTO、c-Myc、CEBPA蛋白在耐药细胞株中的表达 情况 West er n bl o t检测结果显示,经抑制剂MA处 理后FTO、c-My c在耐药细胞株中表达明显减少，而 CEBP A在耐药细胞株中明显增多。见图7。2.8经抑制剂MA处理后耐药细胞对利妥昔单抗 耐药性的影响CCK-8法结果显示，经MA处理后J J 4 3 2 1 4 3 2 1 o o o o o o o oo o o o o o 1A 1A 1A 1-1A1A 1A 1A 1-1ALY8R12 310 10 10FL1-H:FITCLY8R+利妥昔单抗LY18R6 LY1810 U1O5V*LY18R+利妥昔单抗5 45 4 o oo o1A1A3 2 103 2 10 o o o oo o o o 1A 1A 1A 1X1A 1A 1A 1X IdId:H Hn Hn HLY812 310 10 10FL1-H:FITC100 rio5io4io3io2io110io1 io2 io3FL1-H:FITCLY8+利妥昔单抗a-呻*:碎r V-严 qa2kJ104-12 3 410 10 10 10 FL1-H:FITC只斗刹算吾茁一站12 3 410 10 10 10 FL1-H:FITC()+J專舉5050*工图2利妥昔单抗处理亲本细胞株与耐药细胞株的凋亡差异 a：LY8；b：LY8+利妥昔单抗;c：LY8R；d：LY8R+利妥昔单 抗；e：LY18；f：LY18+利妥昔单抗；g：LY18R；h：LY18R+利妥昔#单抗;与LY8组比较：*P 0.001；与LY18组比较 严P T 0.0010*-ab安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y;58(5)7630 I-LLY8 LY8R*wfe極 O J UFTOc-My cCEBP ALY18 LY18R、k u6057 654237图3 RT-qPCR检测去甲基化酶FTO在亲本与 耐药DLBCL细胞株中的表达情况与 LY8 组比较：*P 0.000 1；与 LY18 组比较:*P 0.01LY8 LY8R*-*FTOMer g ea ba bd dDAP IGAP D 且图 5 Western blot 检测 FTO、c Myc 及 CEBPA在亲本及耐药DLBCL细胞株的表达与 LY8 组比较：*P 0.01；与 LY18 组比较:0.01,0.0011.51.5.0.5.0.5.0.5.0.52.1 2.1 1 1 o oT_-丁*旳帐反誓O l d,5,51.O.1.O.0*.o.5.o.5LaLa*坦來蛊Q L HEY8R LY8R+MA011-LY18R LY18R+MA图6 RT-qPCR检测经抑制MA处理后FTO在 耐药细胞株中的表达情况与 LY8R 组比较：*P 0.000 1；与 LY18R 组比较:mP0.001 a bd图4免疫荧光检测FTO蛋白在亲本与耐药 DLBCL细胞株中的表达情况X400a：LY8；b：LY8R；c：LY18；d：LY18R；与 LY8 组比较：*P 0.01；与 LY18 组比较:*P 0.01的 LY8R 和 LY18R 在 0、2、10、50、100 p,g/ml 的利妥 昔单抗刺激48 h后，细胞活力明显低于对照组，差 异有统计学意义(t=16.37、11.96,均P 0.001),这表明抑制剂MA可能影响了 DLBCL对利妥昔单 抗的耐药性。见图8。3讨论常规化疗和靶向治疗是大部分肿瘤的一线治疗 方法,大多数早期肿瘤患者能取得完全或部分缓解,而晚期肿瘤患者往往治疗效果不佳，肿瘤细胞可通 过多因素的耐药机制逃避化疗和靶向治疗。肿 瘤耐药的机制包括药物代谢改变、药物转运失调和 靶蛋白/受体改变等，这些都影响药物与其靶标的有 效结合，也是抗癌药物疗效不佳的主要原因。利 妥昔单抗作为治疗DLBCL的一线药物，在临床治疗 上发挥重要作用,但耐药是患者最大的治疗障碍,尽 764 安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y;58(5)FTOLY8R LY8R+MA LY18R LY18R+MA k u6043210GAP DHc-My cCEBP A LY8RNLY8R+MA t t n in LYi8R 丘 LY18R+MAFTO37c-My c*CEBP A57 6542图 7 Western blot 检测经 MA 处理后,FTO、c-Myc、CEBPA蛋白在耐药细胞株中的表达情况与 LY8R 组比较：*P 0.01,*P 0.001；与 LY18R 组比 较严P v O ooi 严pa 000 1 LY8R-LY8R+MAo oo o o 5o 51111()#悴顒0-1-1-1-10 2 10 50 100利妥昔单抗药物浓度()*便置图8 CCK-8法测定细胞存活率管现如今对利妥昔单抗耐药机制尚不清楚，但越来 越多的研究表明RNA m6A甲基化修饰促进了肿瘤 的发生发展与耐药，如FTO通过作用于G6P D/P ARP 1,促进结直肠癌进展和化疗耐药，靶向抑制FTO能抑制癌细胞生长并提高化疗敏感性问。FTO通过信号转导因子和转录激活因子3(sig n a l t r a n sd u c er s a n d a c t iv a t o r s o f t r a n sc r ipt io n 3,STAT3)参 与乳腺癌对阿霉素耐药过程,FTO启动子区域存在 STAT3结合位点，能激活乳腺癌细胞STAT3信号,而STAT3的过度激活与乳腺癌耐药相关，因此过表 达FTO会引起乳腺癌细胞对阿霉素的耐药oMYC是研究最广泛的致癌基因之一，其参与调 节细胞生长、细胞周期、分化、凋亡、DNA修复、蛋白 质翻译、免疫反应和干细胞形成等过程。MYC 基因扩增与卵巢癌、食管癌、鳞状肺癌、乳腺癌等预 后不良相关。MYC染色体重排已被确定为DL-BCL患者预后不良因素之一,这提示MYC的异 常参与了 DLBCL耐药过程。研究发现，R-2HG 可通过抑制FTO来促进MYC/CEBP A的甲基化水 平并促进m6A依赖的mRNA降解,从而在AML中 发挥抑癌作用。DLBCL利妥昔单抗耐药机制中是 否与代谢通路相关,尤其是糖酵解通路等,有待进一 步研究。本研究采用梯度加药法构建利妥昔单抗耐药细 胞系,并用流式细胞术检测细胞凋亡率,West er n bl o t 证明去甲基化酶FTO在耐药株中表达升高,c-My c 表达也增高,CEBP A表达降低，此外,耐药株经MA 处理后,FTO表达下降且c-My c表达也降低,CEBP A 表达升高，这提示其可能通过FTO/c-My c/CEBP A 轴发挥利妥昔单抗抗性作用。CCK-8法结果显示,耐药株经MA处理后,细胞活力降低，表明MA可能 影响DLBCL对利妥昔单抗的敏感性。目前对于利 妥昔单抗耐药尚无相关药物进入临床使用，关于利 妥昔单抗耐药机制仍需进一步深入研究。参考文献1 Li S,Yo u n g K H,Med eir o s L J.Dif iiise l a r g e B-c el l l y mph o ma J.P a t h o l o g y,2018,50(1)：74-87.2 Co if f ier B,Th iebl emo n t C,Va n Den Nest e E,et a l.Lo n g-t er m o u tc o me o f pa t ien t s in t h e LNH-98.5 t r ia l,t h e f ir st r a n d o mized st u d y c o mpa r in g r it u x ima b-CHOP t o st a n d a r d CHOP c h emo t h er a py in DLBCL pa t ien t s:a st u d y by t h e Gr o u pe d#Et u d es d es Ly mph o mes d e r Ad u l t e J.Bl o o d,2010,116(12)：2040-5.3 Mey er K D,P a t il D P,Zh o u J,et a l.5 UTR m(6)A pr o mo t es c a pin d epen d en t t r a n sl a t io n J.Cel l,2015,163(4)：999-1010.4 Au 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a n c in g met a bo l ism,pr o l if er a t io n a n d o n c og en esis J.Fr o n t Med,2018,12(4)：412-25.14 Sc h a u b F X,Dh a n k a n i V,Ber g er A C,et a l.P a n-c a n c er a l t er a t io n s o f t h e MYC o n c o g en e a n d it s pr o x ima l n et w o r k a c r o ss t h e c a n c er g en o me a t l a s J.Cel l Sy st,2018,6(3)：282-300.15 Jo h n so n N A,Sl a c k G W,Sa v a g e K J,et a l.Co n c u r r en t ex pr essio n o f MYC a n d BCL2 in d if f u se l a r g e B-c el l l y mph o ma t r ea t ed w it h r it u x ima b pl u s c y c l o ph o sph a mid e,d o x o r u bic in,v in c r ist in e,a n d pr ed n iso n ef J.J Cl in On c o l,2012,30(28)：3452-9.Effect of FTO and inhibitor on rituximab resistance in DLBCLGu Jiw ei1,2,Sh i Mei2,So n g Gu o q i1,2(1 Medical School of Nantong University,Nantong 226001；空Dept of Haematology,Affiliated Hospital of Nantong University,Nantong 226001)Abstract Obje c t ive To ex pl o r e t h e ef f ec t o f FTO(f a t ma ss a n d o besit y-a sso c ia t ed pr o t ein)a n d in h ibit o r o n r it u xima b r esist a n c e in DLBCL(d if f u se l a r g e B c el l l y mph o ma).Me t hods Tw o c el l l in es d er iv ed f r o m w d o u bl e st r ik e”l y mph o ma w er e sel ec t ed,a c t iv a t ed B-c el l-l ik e(ABC)OCI-LY8(LY8)a n d g er min a l c en t er B-c el l-l ik e(GCB)OCI-LY18(LY18),a n d r it u x ima b-r esist a n t DLBCL c el l l in es(LY8R a n d LY18R)w er e c o n st r u c t ed by c o n c ent r a t io n g r a d ien t d o sin g met h o d.Th e CCK-8 met h o d w a s u sed t o d et ec t t h e c el l su r v iv a l r a t e o f d if f er en t c o n c en t r at io n s o f r it u x ima b a f t er in t er f er in g w it h t h e pa r en t a l a n d d r u g-r esist a n t c el l s,a n d t h e h a l f ma x ima l in h ibit o r y c o n c ent r a t io n(IC50)w a s c a l c u l a t ed；An n ex in V/P I d o u bl e st a in in g met h o d w a s u sed t o d et ec t t h e a po pt o t ic r a t e o f pa r en t c el l s a n d d r u g-r esist a n t c el l s；q RT-RCR,immu n o f l u o r esc en c e a n d West er n bl o t w er e u sed t o d et ec t t h e ex pr essio n o f d emet h y l a se FTO in r it u x ima b-r esist a n t c el l s.Th e ex pr essio n o f FTO w a s in h ibit ed by a d d in g mec l o f en a mic a c id(MA)t o d r u g-r esist a n t c el l l in es,a n d t h e in h ibit io n w a s v er if ied by RT-q RCR a n d West er n bl o t.Th e ex pr essio n o f c-My c a n d CEBP A in d r u g-r esist a n t st r a in s a f t er in h ibit in g FTO w a s d et ec t ed by u sin g West er n bl o t.Re sult s Co mpa r ed w it h t h e pa r en t c el l s,t h e ex pr essio n o f d emet h y l a se FTO a n d c-My c in c r ea sed,a n d t h e ex pr essio n o f CEBP A d ec r ea sed in t h e r it u x ima b-r esist a n t c el l l in es,w it h st a t ist ic a l sig n if ic a n c e(P 0.01).Af t er t h e d r u g-r esist a n t c el l l in es t r ea t ed w it h MA,t h e ex pr essio n o f FTO a n d c-My c d ec r ea sed a n d CEBP A in c r ea sed,a l l w it h st a t ist ic a l l y sig n if ic a n t d if f er en c es(P 0.01).Conc lusion Th e ex pr essio n o f FTO in d r u g-r esist a n t DLBCL sig n if ic a n tl y in c r ea ses,a n d MA in h ibit s t h e ex pr essio n o f FTO in d r u g-r esist a n t c el l s,w h ic h ma y h a v e t h er a peu t ic po t en t ia l f o r r it u x ima b-r esist a n t DLBCL.Key words d if f u se l a r g e B-c el l l y mph o ma；r it u x ima b；FTO；c-My c