生物化学实验市公开课一等奖百校联赛特等奖课件.pptx

生生 物物 化化 学学 实实 验验第1页第2页四、试验室规则1.穿工作服。2.严格按操作规程使用仪器设备。3.试验完成后，洗净所用器材。4.每次一个试验小组(轮番)做清洁卫生。第3页五、试验汇报书写实 验 名 称1.目要求 日期2.实验原理3.主要方法及仪器4.基本操作过程5.现象与绘图6.计算或结果7.意义8.注意事项9.讨论与小结10.思考题第4页试验一试验一 分光光度法分光光度法第5页一、实验目：一、实验目：l掌握掌握分光光度法概念、基本原理和应用；并经过分光光度法概念、基本原理和应用；并经过试验试验了解了解分光光度计操作方法和步骤以及分光光度计操作方法和步骤以及了解了解分分光光度计主要组成部件与工作原理。光光度计主要组成部件与工作原理。第6页单色光与复色光单色光与复色光单色光单色光:仅含有某一波长光，由含有相同能量光子所组成。仅含有某一波长光，由含有相同能量光子所组成。复色光复色光:与上相反，各种人眼可见色光都属复色光。与上相反，各种人眼可见色光都属复色光。第7页射线射线x射射线线真空紫外真空紫外近紫外近紫外可见可见近红外近红外红外红外远红外远红外无线电波无线电波380760nm10m200380nm第8页二、分光光度法概念二、分光光度法概念l分分光光光光度度法法是是基基于于被被测测物物质质分分子子对对光光含含有有选选择择性性吸吸收收特特征征而而建建立立起起来来分分析析方方法法（也也称为吸光光度法）。称为吸光光度法）。第9页l在在分分光光光光度度计计中中，将将不不一一样样波波长长光光连连续续照照射射到到一一定定浓浓度度样样品品溶溶液液时时，便便可可得得出出与与不不一一样样波波长长相相对对应应吸吸收收强强度度。如如以以波波长长（）为为横横坐坐标标，吸吸收收强强度度（A）为为纵纵坐坐标标，就就可可绘绘出出该该物物质质吸吸收收光光谱谱曲曲线。利用该曲线能够进行物质定性、定量分析。线。利用该曲线能够进行物质定性、定量分析。第10页特点特点灵敏度高灵敏度高：测定下限可达：测定下限可达105106mol/L,10-4%10-5%准确度准确度能够满足微量组分测定要求：能够满足微量组分测定要求：相对误差相对误差25（12）操作简便快速操作简便快速应用广泛应用广泛第11页三、三、分光光度法基本原理分光光度法基本原理第12页1.物质对光选择性吸收 吸收吸收(absorption):一一个个物物质质展展现现何何种种颜颜色色，是是与与入入射射光光组组成成和和物物质质本本身身结结构构相相关关。溶溶液液展展现现不不一一样样颜颜色色是是由由溶溶液液中中质质点点（离离子子或或分分子子）对对不不一一样样波波长长光光含含有有选选择择性性吸收而引发。吸收而引发。第13页 当依次将各种波长单色光经过某一有色溶液当依次将各种波长单色光经过某一有色溶液,测测量每一波长下有色溶液对该波长光吸收程度量每一波长下有色溶液对该波长光吸收程度(吸吸光度光度A)，然后以，然后以波长波长为横坐标，为横坐标，吸光度吸光度为纵坐为纵坐标作图，得到一条曲线，称为该溶液标作图，得到一条曲线，称为该溶液吸收光谱吸收光谱。吸收光谱吸收光谱第14页可见、紫外吸收光谱示意图可见、紫外吸收光谱示意图第15页 物质对不一样色光能有选择性吸收物质对不一样色光能有选择性吸收,即一定物即一定物质主要吸收一定波长光质主要吸收一定波长光(互补吸收互补吸收)，是因为物质，是因为物质本身分子、原子都处于一定能级运动状态，当物本身分子、原子都处于一定能级运动状态，当物质吸收了光辐射能以后，会产生能级跃迁，产生质吸收了光辐射能以后，会产生能级跃迁，产生吸收光谱。吸收光谱。吸收光谱产生吸收光谱产生第16页2.光吸收基本定律 依据吸收光谱特征和形状可作该物质判别、纯度依据吸收光谱特征和形状可作该物质判别、纯度检验和初步结构分析等。不过可见紫外吸收光检验和初步结构分析等。不过可见紫外吸收光谱主要应用在定量分析方面，其定量基础即为谱主要应用在定量分析方面，其定量基础即为Lamber-Beer定律，是说明吸光物质对单色光定律，是说明吸光物质对单色光吸收强弱与该物质浓度与厚度间关系定律。吸收强弱与该物质浓度与厚度间关系定律。第17页透光度透光度T(%)与吸光度与吸光度A第18页 透光度透光度 T(%)当一束平行单色光经过一浓度为当一束平行单色光经过一浓度为C，液层厚，液层厚度为度为L溶液时，该溶液将对此入射光进行吸收，溶液时，该溶液将对此入射光进行吸收，使透过光强减弱。透光度则为入射前后光强使透过光强减弱。透光度则为入射前后光强比值。比值。CL入射光强透射光强I0ItT(%)ItI0第19页透光度与吸光度相互关系透光度与吸光度相互关系溶液透光度与吸光度呈负相关。溶液透光度与吸光度呈负相关。AlgI0ItlglgT1T吸光度吸光度A吸光度吸光度A是透光度负对数是透光度负对数第20页 1.Lamber定律定律吸光度与液层厚度关系吸光度与液层厚度关系 1760年，年，Lamber指出，当单色光经过浓指出，当单色光经过浓度一定、均匀吸收溶液时，该溶液对光吸收度一定、均匀吸收溶液时，该溶液对光吸收程度与液层厚度程度与液层厚度L成正比。成正比。AlgI0ItK1LLamber-Beer 定律定律第21页吸光度与光程（厚度：L）关系 A=KLc 检测器检测器L样品样品光源光源0.22吸光度吸光度光源光源检测器检测器0.00吸光度吸光度光源光源检测器检测器0.44吸光度吸光度L样品样品L样品样品第22页2.Beer 定律定律吸光度与溶液中吸光物吸光度与溶液中吸光物质浓度关系关系质浓度关系关系 1852年，年，Beer 指出，当单色光经指出，当单色光经过液层厚度一定、均匀吸收溶液时，过液层厚度一定、均匀吸收溶液时，该溶液对光吸收程度与溶液中吸光该溶液对光吸收程度与溶液中吸光物质浓度物质浓度C成正比。成正比。AlgI0ItK2C第23页吸光度与浓度关系 A=KLc 吸光度吸光度0.00光源光源检测器检测器 吸光度吸光度0.22光源光源检测器检测器c1 吸光度吸光度0.44光源光源检测器检测器c2第24页3.Lamber-Beer 定律定律 将前面两条定律结合起来，就得到以下结果将前面两条定律结合起来，就得到以下结果：AKCL K:吸光系数，为单位浓度、单位厚度时吸光度。吸光系数，为单位浓度、单位厚度时吸光度。C:吸光物质浓度。单位吸光物质浓度。单位mol/L L:光经过液层厚度。单位光经过液层厚度。单位cm第25页A=klc A 吸光度吸光度(absorbance)L 介质厚度介质厚度(length/cm)c 浓度浓度(concentration)K 吸光系数吸光系数(absorptivity)AlgI0ItItI0lc第26页四、四、分光光度计基本结构分光光度计基本结构第27页分光光度计基本结构分光光度计基本结构光源光源单色器单色器吸收池吸收池检测系统检测系统稳压电源稳压电源第28页722型分光光度计结构方框图光光源源吸收池吸收池检测系统检测系统分光分光系统系统显示系统显示系统第29页 在分光光度计上外来光源（混合光）经过棱镜在分光光度计上外来光源（混合光）经过棱镜或光栅得到一束近似单色光或光栅得到一束近似单色光.即将混合光中某一即将混合光中某一波长单色光分出，故称为波长单色光分出，故称为“分光分光”。优点：波长可调优点：波长可调,故选择性好故选择性好,准确度高准确度高.第30页 光源必须含有稳定足够强度连续光谱。光源必须含有稳定足够强度连续光谱。可见光分光光度计可见光分光光度计光源通常为白灼钨灯，其光谱光源通常为白灼钨灯，其光谱范围为范围为320nm-2500nm。紫外分光光度计紫外分光光度计光源是低压氢弧灯，其光谱范围光源是低压氢弧灯，其光谱范围为为150nm-400nm。1.光源光源第31页 单色单色器器是将复杂白光分散成单色光装置，是将复杂白光分散成单色光装置，其过程为光色散。色散后单色光经反射、聚其过程为光色散。色散后单色光经反射、聚光，经过狭缝抵达溶液。光，经过狭缝抵达溶液。惯用单色器是棱镜或光栅。惯用单色器是棱镜或光栅。2.单色器单色器第32页 也叫比色皿也叫比色皿,比色杯，用来盛被测试溶液。比色杯，用来盛被测试溶液。可见光区使用玻璃制比色皿，紫外光区使用可见光区使用玻璃制比色皿，紫外光区使用石英制比色皿。因为玻璃会吸收紫外线。石英制比色皿。因为玻璃会吸收紫外线。吸收池种类很多，其光径可在吸收池种类很多，其光径可在0.110cm之间，其中以之间，其中以1cm光径吸收池最为惯用。光径吸收池最为惯用。3.吸收池吸收池第33页 即光电转换元件，为光电管或光电倍增管，可即光电转换元件，为光电管或光电倍增管，可将透过比色皿光信号变成可测量电信号。将透过比色皿光信号变成可测量电信号。4.检测器检测器第34页5.显示仪表或统计仪显示仪表或统计仪可直接读到结果，如检流计，微安表。可直接读到结果，如检流计，微安表。第35页五、定量分析方法 标准曲线法0浓度C吸光度A第36页几点注意：1.理想标准曲线应为：用不一样浓度标准溶液所测得吸光度对浓度作图时，是一条斜率靠近于1经过原点直线；2.标准溶液浓度范围应在被测物质浓度二分之一到二倍之间；3.吸光度在0.05-1.0之间为宜。第37页 对比法将标准与样品分别在相同条件下显色，测定其吸光度。因是相同物质在相同条件下测定，故可按下式计算出样品浓度：A标A样KC样LKC标L=则：C样=A标A样C标第38页六显色反应条件选择对各种物质进行测定，常利用显色反应将被测组分转变为在一定波长范围有吸收物质。第39页这些显色反应，必须满足以下条件：1反应生成物必须在紫外紫外-可见光区可见光区有较较强强吸光能力吸光能力，即摩尔吸光系数较大；2反应有较高选择性较高选择性，即被测组分生成化合物吸收曲线应与共存物质吸收光谱有显著差异；第40页3反应生成产物有足够稳定性足够稳定性，以确保测量过程中溶液吸光度不变；4反应生成物组成恒定。第41页七、试验步骤：七、试验步骤：l1、开机、开机 l2、预热、预热 l3、选择检测波长、选择检测波长 l4、调整仪器零点、调整仪器零点 l5、调整吸光度零点、调整吸光度零点 l6、读取测定管和标准管吸光度、读取测定管和标准管吸光度l7、计算试验数据、计算试验数据(单位浓度单位浓度)l8、讨论与小结讨论与小结第42页l本内容结束，谢谢！第43页