生物化学实验技术市公开课一等奖百校联赛特等奖课件.pptx
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1、生物化学试验技术农业生物学试验教学中心制作人:张杰道制作人:张杰道第1页农业生物学实验教学中心目 录PCR反应原理PCR类型和应用PCR示例第2页农业生物学实验教学中心 多聚酶链式反应多聚酶链式反应(PCR:Polymerase Chain Reaction)Kary B.MullisKary B.Mullis PCR是由美国科学家是由美国科学家穆利斯提出一个穆利斯提出一个体外简化条件下模拟体外简化条件下模拟DNADNA体内复制体内复制DNADNA快速扩增方法,此技术取得快速扩增方法,此技术取得19931993年诺贝年诺贝尔化学奖。尔化学奖。第3页农业生物学实验教学中心体内体内DNADNA复制
2、体系复制体系DNADNADNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶(I II IIII II IIII II IIII II III)拓扑异构酶拓扑异构酶拓扑异构酶拓扑异构酶解旋酶类解旋酶类解旋酶类解旋酶类SSBSSBSSBSSB 引物引物引物引物dNTP MgdNTP MgdNTP MgdNTP Mg2+2+2+2+5 5 33第4页农业生物学实验教学中心MullisPCR构思构思引物引物引物引物DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA聚合酶聚合酶特定特定DNADNA片段片段第5页TaqTaq DNADNA聚合酶(聚合酶(thermus aquaticus)thermus aquaticus)酶活性酶
3、活性酶活性酶活性(%)(%)温度温度温度温度()40 50 60 70 80 90 100100 80 60 40 20耐热耐热DNADNA聚合酶聚合酶Saiki(1988)将耐热)将耐热DNA聚合酶引入聚合酶引入PCR,使利用热变性解链,使利用热变性解链DNA模板可行。模板可行。第6页农业生物学实验教学中心PCR反应循环反应循环7272949494945555PCRPCR循环循环循环循环变性变性变性变性退火退火退火退火延伸延伸延伸延伸第7页农业生物学实验教学中心 PCRPCRPCRPCR指数扩增(指数扩增(指数扩增(指数扩增(2 2 2 2n n n n)引物引物引物引物延伸延伸延伸延伸延伸
4、延伸延伸延伸5 5 5 53 33 3变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火第8页农业生物学实验教学中心TaqTaqP1P1P2P2PCR反应体系dATPdTTPdGTPdCTPMg2+模板:模板:DNA引物:引物:P1 P2DNA聚合酶:聚合酶:Taq原料:原料:dNTP反应缓冲液反应缓冲液辅助因子:辅助因子:Mg2+第9页农业生物学实验教学中心1 1)PCRPCR反应成份反应成份(1 1 1 1)模板)模板)模板)模板 单、双链单、双链DNADNA均可。均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、不能混有蛋白酶、核酸酶、DNADNA聚合酶抑制剂、聚合酶抑制剂、D
5、NADNA结合蛋白类。结合蛋白类。DNA DNA模板普通模板普通100ng/100100ng/100 L L。模板浓度过高会造成反应非特异性增加。模板浓度过高会造成反应非特异性增加。PCR反应条件第10页农业生物学实验教学中心(2 2 2 2)引物浓度)引物浓度)引物浓度)引物浓度 0.1-0.5 0.1-0.5 mol/Lmol/L 浓度过高易造成模板与引物错配浓度过高易造成模板与引物错配,反应特异性下降。反应特异性下降。(3 3 3 3)TaqTaqTaqTaq DNADNADNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶 0.5-2.5 U/50 0.5-2.5 U/50 l l 酶量增加使反应特异
6、性下降酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。酶量过少影响反应产量。第11页农业生物学实验教学中心(4 4 4 4)dNTPdNTPdNTPdNTP dNTPdNTP浓度取决于扩增片段长度浓度取决于扩增片段长度 四种四种dNTPdNTP浓度应相等浓度应相等 浓度过高易产生错误碱基掺入浓度过高易产生错误碱基掺入,浓度过低则降低浓度过低则降低反应产量反应产量 dNTP dNTP可与可与Mg2+Mg2+结合结合,使游离使游离Mg2+Mg2+浓度下降浓度下降,影响影响DNADNA聚合酶活性。聚合酶活性。第12页农业生物学实验教学中心(5 5 5 5)Mg2+Mg2+Mg2+Mg2+Mg2+Mg
7、2+是是DNADNA聚合酶激活剂。适宜浓度为聚合酶激活剂。适宜浓度为0.5-0.5-2.5mmol/L2.5mmol/L反应体系。反应体系。Mg2+Mg2+浓度过低会使浓度过低会使TaqTaq酶活性丧失、酶活性丧失、PCRPCR产量下降;产量下降;Mg2+Mg2+过高影响反应特异性。过高影响反应特异性。Mg2+Mg2+可与负离子结合可与负离子结合,所以反应体系中所以反应体系中dNTPdNTP、EDTAEDTA等浓度影响反应中游离等浓度影响反应中游离Mg2+Mg2+浓度。浓度。第13页农业生物学实验教学中心2 2 2 2)循环参数)循环参数)循环参数)循环参数(1)(1)变性变性变性变性 (2)
8、使双链使双链DNADNA解链为单链解链为单链 94 94,20-30 20-30秒秒(2)(2)(2)(2)退火退火退火退火 温度由引物长度和温度由引物长度和GCGC含量决定。含量决定。增加温度能降低引物与模板非特异性结合增加温度能降低引物与模板非特异性结合;降低降低温度可增加反应灵敏性。温度可增加反应灵敏性。第14页农业生物学实验教学中心(3 3 3 3)延伸)延伸)延伸)延伸 70-75,70-75,普通为普通为7272 延伸时间由扩增片段长度决定延伸时间由扩增片段长度决定(4 4 4 4)循环次数)循环次数)循环次数)循环次数 主要取决于模版主要取决于模版DNADNA浓度浓度 普通为普通
9、为25-3525-35次次 次数过多:扩增效率降低次数过多:扩增效率降低 错误掺入率增加错误掺入率增加第15页农业生物学实验教学中心PCR技术特点1 1 1 1)高度灵敏性)高度灵敏性)高度灵敏性)高度灵敏性30303030轮循环轮循环轮循环轮循环扩增量达扩增量达230230个拷贝(个拷贝(109109拷贝)拷贝)PCRPCR产物每轮循环增加一倍产物每轮循环增加一倍第16页农业生物学实验教学中心2 2 2 2)特异性)特异性)特异性)特异性引物引物引物引物引物引物引物引物 引物序列及其与模板结合特异性是决定引物序列及其与模板结合特异性是决定PCRPCR反反 应结果关键。应结果关键。引物设计最大
10、标准是最大程度地提升扩增效率和引物设计最大标准是最大程度地提升扩增效率和 特异性;同时尽可能降低非特异性扩增。特异性;同时尽可能降低非特异性扩增。第17页农业生物学实验教学中心引物设计:引物设计:(1)1)序列应位于高度保守区序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源与非扩增区无同源 序列。序列。(2 2)引物长度以)引物长度以15-40 bp15-40 bp为宜。为宜。(3 3)碱基尽可能随机分布碱基尽可能随机分布,G+C,G+C占占40-60%40-60%。(4 4)引物内部防止形成二级结构。)引物内部防止形成二级结构。(5 5)两引物间防止有互补序列。)两引物间防止有互补序列。(6 6)引物
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