生物化学实验技术市公开课一等奖百校联赛特等奖课件.pptx

生物化学试验技术农业生物学试验教学中心制作人：张杰道制作人：张杰道第1页农业生物学实验教学中心目 录PCR反应原理PCR类型和应用PCR示例第2页农业生物学实验教学中心 多聚酶链式反应多聚酶链式反应（PCR：Polymerase Chain Reaction)Kary B.MullisKary B.Mullis PCR是由美国科学家是由美国科学家穆利斯提出一个穆利斯提出一个体外简化条件下模拟体外简化条件下模拟DNADNA体内复制体内复制DNADNA快速扩增方法，此技术取得快速扩增方法，此技术取得19931993年诺贝年诺贝尔化学奖。尔化学奖。第3页农业生物学实验教学中心体内体内DNADNA复制体系复制体系DNADNADNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶（I II IIII II IIII II IIII II III）拓扑异构酶拓扑异构酶拓扑异构酶拓扑异构酶解旋酶类解旋酶类解旋酶类解旋酶类SSBSSBSSBSSB 引物引物引物引物dNTP MgdNTP MgdNTP MgdNTP Mg2+2+2+2+5 5 33第4页农业生物学实验教学中心MullisPCR构思构思引物引物引物引物DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA聚合酶聚合酶特定特定DNADNA片段片段第5页TaqTaq DNADNA聚合酶（聚合酶（thermus aquaticus)thermus aquaticus)酶活性酶活性酶活性酶活性(%)(%)温度温度温度温度()40 50 60 70 80 90 100100 80 60 40 20耐热耐热DNADNA聚合酶聚合酶Saiki（1988）将耐热）将耐热DNA聚合酶引入聚合酶引入PCR，使利用热变性解链，使利用热变性解链DNA模板可行。模板可行。第6页农业生物学实验教学中心PCR反应循环反应循环7272949494945555PCRPCR循环循环循环循环变性变性变性变性退火退火退火退火延伸延伸延伸延伸第7页农业生物学实验教学中心 PCRPCRPCRPCR指数扩增（指数扩增（指数扩增（指数扩增（2 2 2 2n n n n）引物引物引物引物延伸延伸延伸延伸延伸延伸延伸延伸5 5 5 53 33 3变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火第8页农业生物学实验教学中心TaqTaqP1P1P2P2PCR反应体系dATPdTTPdGTPdCTPMg2+模板：模板：DNA引物：引物：P1 P2DNA聚合酶：聚合酶：Taq原料：原料：dNTP反应缓冲液反应缓冲液辅助因子：辅助因子：Mg2+第9页农业生物学实验教学中心1 1）PCRPCR反应成份反应成份（1 1 1 1）模板）模板）模板）模板 单、双链单、双链DNADNA均可。均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、不能混有蛋白酶、核酸酶、DNADNA聚合酶抑制剂、聚合酶抑制剂、DNADNA结合蛋白类。结合蛋白类。DNA DNA模板普通模板普通100ng/100100ng/100 L L。模板浓度过高会造成反应非特异性增加。模板浓度过高会造成反应非特异性增加。PCR反应条件第10页农业生物学实验教学中心（2 2 2 2）引物浓度）引物浓度）引物浓度）引物浓度 0.1-0.5 0.1-0.5 mol/Lmol/L 浓度过高易造成模板与引物错配浓度过高易造成模板与引物错配,反应特异性下降。反应特异性下降。（3 3 3 3）TaqTaqTaqTaq DNADNADNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶 0.5-2.5 U/50 0.5-2.5 U/50 l l 酶量增加使反应特异性下降酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。酶量过少影响反应产量。第11页农业生物学实验教学中心（4 4 4 4）dNTPdNTPdNTPdNTP dNTPdNTP浓度取决于扩增片段长度浓度取决于扩增片段长度 四种四种dNTPdNTP浓度应相等浓度应相等 浓度过高易产生错误碱基掺入浓度过高易产生错误碱基掺入,浓度过低则降低浓度过低则降低反应产量反应产量 dNTP dNTP可与可与Mg2+Mg2+结合结合,使游离使游离Mg2+Mg2+浓度下降浓度下降,影响影响DNADNA聚合酶活性。聚合酶活性。第12页农业生物学实验教学中心（5 5 5 5）Mg2+Mg2+Mg2+Mg2+Mg2+Mg2+是是DNADNA聚合酶激活剂。适宜浓度为聚合酶激活剂。适宜浓度为0.5-0.5-2.5mmol/L2.5mmol/L反应体系。反应体系。Mg2+Mg2+浓度过低会使浓度过低会使TaqTaq酶活性丧失、酶活性丧失、PCRPCR产量下降；产量下降；Mg2+Mg2+过高影响反应特异性。过高影响反应特异性。Mg2+Mg2+可与负离子结合可与负离子结合,所以反应体系中所以反应体系中dNTPdNTP、EDTAEDTA等浓度影响反应中游离等浓度影响反应中游离Mg2+Mg2+浓度。浓度。第13页农业生物学实验教学中心2 2 2 2）循环参数）循环参数）循环参数）循环参数(1)(1)变性变性变性变性 (2)使双链使双链DNADNA解链为单链解链为单链 94 94，20-30 20-30秒秒(2)(2)(2)(2)退火退火退火退火 温度由引物长度和温度由引物长度和GCGC含量决定。含量决定。增加温度能降低引物与模板非特异性结合增加温度能降低引物与模板非特异性结合;降低降低温度可增加反应灵敏性。温度可增加反应灵敏性。第14页农业生物学实验教学中心（3 3 3 3）延伸）延伸）延伸）延伸 70-75,70-75,普通为普通为7272 延伸时间由扩增片段长度决定延伸时间由扩增片段长度决定（4 4 4 4）循环次数）循环次数）循环次数）循环次数 主要取决于模版主要取决于模版DNADNA浓度浓度 普通为普通为25-3525-35次次 次数过多：扩增效率降低次数过多：扩增效率降低 错误掺入率增加错误掺入率增加第15页农业生物学实验教学中心PCR技术特点1 1 1 1）高度灵敏性）高度灵敏性）高度灵敏性）高度灵敏性30303030轮循环轮循环轮循环轮循环扩增量达扩增量达230230个拷贝（个拷贝（109109拷贝）拷贝）PCRPCR产物每轮循环增加一倍产物每轮循环增加一倍第16页农业生物学实验教学中心2 2 2 2）特异性）特异性）特异性）特异性引物引物引物引物引物引物引物引物 引物序列及其与模板结合特异性是决定引物序列及其与模板结合特异性是决定PCRPCR反反 应结果关键。应结果关键。引物设计最大标准是最大程度地提升扩增效率和引物设计最大标准是最大程度地提升扩增效率和 特异性；同时尽可能降低非特异性扩增。特异性；同时尽可能降低非特异性扩增。第17页农业生物学实验教学中心引物设计：引物设计：（1)1)序列应位于高度保守区序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源与非扩增区无同源 序列。序列。（2 2）引物长度以）引物长度以15-40 bp15-40 bp为宜。为宜。（3 3）碱基尽可能随机分布碱基尽可能随机分布,G+C,G+C占占40-60%40-60%。（4 4）引物内部防止形成二级结构。）引物内部防止形成二级结构。（5 5）两引物间防止有互补序列。）两引物间防止有互补序列。（6 6）引物）引物33端为关键碱基；端为关键碱基；5 5端无严格限制。端无严格限制。第18页农业生物学实验教学中心3 3 3 3）操作简便易行）操作简便易行）操作简便易行）操作简便易行 利用利用PCRPCR扩增扩增,只需要数小时只需要数小时,就能够扩增出就能够扩增出 可用可用电泳法检出电泳法检出DNADNA，可用于检测基因组中仅含数个拷贝，可用于检测基因组中仅含数个拷贝模板序列。模板序列。第19页农业生物学实验教学中心1 1 1 1）不对称）不对称）不对称）不对称PCRPCRPCRPCR 目标：扩增产生特异长度单链目标：扩增产生特异长度单链DNADNA。方法：采取两种不一样浓度引物。分别称为限制性方法：采取两种不一样浓度引物。分别称为限制性引物和非限制性引物引物和非限制性引物,其最正确百分比普通是其最正确百分比普通是0.010.5M,0.010.5M,关键是限制性引物绝对量。关键是限制性引物绝对量。用途：制备核酸序列测定模板；制备杂交探针；用途：制备核酸序列测定模板；制备杂交探针；基因组基因组DNADNA结构功效研究结构功效研究 PCRPCR类型第20页 高浓度引物高浓度引物低浓度引物低浓度引物第21页农业生物学实验教学中心2)2)2)2)反向反向反向反向PCR(reverse PCR)PCR(reverse PCR)PCR(reverse PCR)PCR(reverse PCR)用反向互补引物来扩增两引物以外用反向互补引物来扩增两引物以外DNADNA片段，对某片段，对某个已知个已知DNADNA片段两侧未知序列进行扩增。片段两侧未知序列进行扩增。未知序列未知序列未知序列未知序列已知序列已知序列第22页农业生物学实验教学中心已知序列已知序列未知序列未知序列未知序列未知序列限制酶限制酶限制酶限制酶限制酶限制酶限制酶限制酶连接酶连接酶第23页农业生物学实验教学中心3 3 3 3）多重）多重）多重）多重PCRPCRPCRPCR（复合（复合（复合（复合PCRPCRPCRPCR）用于检测特定基因序列存在或缺失。用于检测特定基因序列存在或缺失。第24页农业生物学实验教学中心电电电电泳泳泳泳引物引物12341234第25页农业生物学实验教学中心4 4 4 4）LP-PCRLP-PCRLP-PCRLP-PCR（Labelled primers)Labelled primers)Labelled primers)Labelled primers)利用同位素、荧光素等对引物进行标识利用同位素、荧光素等对引物进行标识,用以直观地检测目标基因。用以直观地检测目标基因。尤其适合大量临床标本基因诊疗尤其适合大量临床标本基因诊疗 可同时检测各种基因成份可同时检测各种基因成份第26页农业生物学实验教学中心标识引物标识引物标识引物标识引物观察观察PCRPCR产物产物第27页农业生物学实验教学中心5 5 5 5）锚定）锚定）锚定）锚定PCRPCRPCRPCR（anchored PCR,A-PCRanchored PCR,A-PCRanchored PCR,A-PCRanchored PCR,A-PCR）锚定PCR首先合成第一链cDNA,然后再添加一同聚物尾（polydG),与同聚物尾配对3锚定引物（带有限制性内切位点polydC)一起作PCR扩增第28页农业生物学实验教学中心cDNAcDNA末端核酸转移酶末端核酸转移酶3GGGG3GGGG55CCCC CCCC 锚定引物锚定引物锚定引物锚定引物3GGGG3GGGG55CCCCCCCC3GGGG3GGGGCCCCCCCC第29页农业生物学实验教学中心6 6 6 6）PCRPCRPCRPCR固相分析法固相分析法固相分析法固相分析法模模板板生物素生物素化引物化引物PCRPCR扩增扩增探探针针亲和固亲和固相介质相介质检测探检测探针信号针信号可用于基因芯片制作可用于基因芯片制作第30页农业生物学实验教学中心7 7 7 7）原位）原位）原位）原位 原位聚合酶链式反应（原位聚合酶链式反应（In Still PCR,IsIn Still PCR,IsPCRPCR）是）是由由HaaseHaase等于等于19901990年首创。它是利用完整细胞作为一个年首创。它是利用完整细胞作为一个微小反应体系来扩增细胞内目标片段微小反应体系来扩增细胞内目标片段,在不破坏细胞前在不破坏细胞前提下提下,利用一些特定检测伎俩来检测细胞内扩增产物。利用一些特定检测伎俩来检测细胞内扩增产物。直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行扩增。可进行细胞内定位和检测病理切片中进行扩增。可进行细胞内定位和检测病理切片中含量较少靶序列。含量较少靶序列。第31页农业生物学实验教学中心操作步骤1.细胞或组织固定：细胞经固定和乙醇通透化处理后便适于一般PCR试剂（包括引物和Taq酶）进入2.PCR扩增细胞内目片段3.原位杂交检测扩增产物A.阳性对照B.阴性对照C.原位检测mRNA表示第32页农业生物学实验教学中心8 8 8 8）逆转录酶逆转录酶聚合酶聚合酶mRNAcDNA杂化双链杂化双链PCRPCR扩增扩增第33页农业生物学实验教学中心9)9)9)9)荧光定量荧光定量荧光定量荧光定量 PCRPCRPCRPCR（real-time PCR)real-time PCR)real-time PCR)real-time PCR)经过荧光染料或荧光标识特异性探针经过荧光染料或荧光标识特异性探针,对对PCRPCR产产物进行标物进行标 记跟踪记跟踪,实时在线监控反应过程实时在线监控反应过程,结合对结合对应软件能够对结果进行分析应软件能够对结果进行分析,计算待测样品初始模板计算待测样品初始模板量。量。内掺式染料内掺式染料SYBR GreenSYBR Green I序列特异性探针序列特异性探针Taqman Taqman Molecular BeaconsMolecular Beacons Dual Probes(Dual Probes(FRET)FRET)引物特异性探针引物特异性探针 Amplifluor(Intergen)Amplifluor(Intergen)第34页农业生物学实验教学中心5353SGSGSGSGSGExcitationEmissionSYBR-Green ISYBR-Green I 第35页农业生物学实验教学中心 实时荧光定量实时荧光定量PCR仪仪梯度梯度PCR仪仪普通普通PCR仪仪第36页农业生物学实验教学中心PCR示例示例一、实验目学习学习PCRPCR分析原理与技术。分析原理与技术。第37页农业生物学实验教学中心1 1、材料：含、材料：含1Kb1Kb插入片段克隆载体插入片段克隆载体Pmd18-TPmd18-T 质粒质粒DNADNA2 2、仪器：微量移液器及吸头、仪器：微量移液器及吸头、PCRPCR仪及仪及PCRPCR管管 琼脂糖凝胶电泳设备琼脂糖凝胶电泳设备3 3、试剂：、试剂：1010X XPCRPCR 反应缓冲液反应缓冲液 25mmol/L MgCl 25mmol/L MgCl2 2 10mmol/L dNTP10mmol/L dNTP 10 10mol/L mol/L 引物引物1 1和引物和引物2 2二、试验材料、仪器和二、试验材料、仪器和试剂试剂第38页农业生物学实验教学中心1.1.按照以下体积向按照以下体积向PCRPCR管中按次序加入各试剂管中按次序加入各试剂 并混匀：并混匀：10 X PCR反应缓冲液 2.5 L 25mmol/L MgCl2 2.0L 10mmol/L dNTP 1.0 L 10mol/L 引物1 1.0 L 10mol/L引物2 1.0L 质粒DNA 1.0 L Taq 0.1 L(5U)水补充至 25.0 L三、操作步骤三、操作步骤第39页农业生物学实验教学中心2.2.按照以下体积向按照以下体积向PCRPCR管中按次序加入各试剂管中按次序加入各试剂 并混匀：并混匀：10 X PCR反应缓冲液 2.5 L 25mmol/L MgCl2 2.0L 10mmol/L dNTP 1.0 L 10mol/L 引物1 1.0 L 10mol/L引物2 1.0L 质粒DNA 1.0 L Taq 0.1 L(5U)水补充至 25.0 L三、操作步骤三、操作步骤第40页农业生物学实验教学中心第41页农业生物学实验教学中心3.3.反应完成后反应完成后,将反应液与凝胶电泳缓冲液按将反应液与凝胶电泳缓冲液按百分比混匀百分比混匀,上样电泳。上样电泳。三、操作步骤三、操作步骤琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳第42页农业生物学实验教学中心第43页