重组Ⅰ型人源化胶原蛋白“福活因子”的生物合成及其结构表征研究.pdf

医药前沿 2024年1月 第14卷第1期 论著 1重组型人源化胶原蛋白“福活因子”的生物合成 及其结构表征研究全冰华1，王 勇2（通信作者），邓宏鸿1，庞晓明1，滕永慧1，李 璐2,3，方 伟2,4（1 广西福莱明生物制药有限公司 广西 南宁 530031）（2 中华生物医药研究院 广东 深圳 518001）（3 浙江大学药学院 浙江 杭州 310058）（4 武汉大学中南医院口腔科 湖北 武汉 430062）【摘要】目的：筛选获得含胶原蛋白保守序列 hCol.1 基因的重组人源化型胶原蛋白高效表达基因工程菌和高产创新融合蛋白，并通过检测其理化特征验证表达产物。方法：将 His6-SUMO-hCol.1 重组基因大肠杆菌高密度发酵后经镍亲和层析和离子交换层析两步纯化浓缩获得重组蛋白，检测理化测试特征。结果：测序证明克隆基因与 hCol.1 序列高度一致，Blast 比对蛋白序列与人型胶原蛋白高度同源，折叠结构与人型胶原蛋白高度类似。表观分子量 55 60 kD，产量 36.4 mg/L，纯度 95%。等电点检测、氨基酸组成和圆二色谱等实验结合高级结构预测分析，证明其理化性状与蛋白结构符合胶原蛋白特征。结论：成功将人型胶原蛋白保守功能结构域 hCol.1 与 SUMO 等肽段重组融合表达并命名为福活因子（FHTFF），筛选出基因工程菌 pET21a（+）-FHTFF/BL21，纯化产物“福活因子”的理化特性、序列和结构与人、型胶原蛋白肽段高度相似，属于重组人源化胶原蛋白新生物材料。【关键词】重组型人源化胶原蛋白；福活因子；基因工程菌【中图分类号】R94【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2024）01-0001-04Biosynthesis and structural characterization of recombinant type I humanized collagen Fuhuo FactorQUAN Binghua1,WANG Yong2(Corresponding author),DENG Honghong1,PANG Xiaoming1,TENG Yonghui1,LI Lu2,3,FANG Wei 2,41 Guangxi Fulaiming Biopharmaceutical Co.,Ltd.,Nanning,Guangxi 530031,China2 Chinese Academy of Biomedicines,Shenzhen,Guangdong 518001,China3 School of Pharmacy,Zhejiang University,Hangzhou,Zhejiang 310058,China4 Department of Stomatology,Zhongnan Hospital,Wuhan University,Wuhan,Hubei 430062,China【Abstract】Objective To screen and obtain recombinant humanized type I collagen containing collagen conserved sequence hCol.1 gene with high efficiency expression of genetically engineered bacteria and high yield of innovative fusion proteins,and to validate the expression products by detecting their physicochemical characteristics.Methods The recombinant protein was obtained by two-step purification and concentratded by nickel affinity chromatography and ion-exchange chromatography after high-density fermentation of Escherichia coli with the recombinant gene of His6-SUMO-hCol.1,and the physicochemical characteristics were detected.Results Sequencing proved that the cloned gene was highly consistent with the sequence of hCol.1,and the Blast of protein sequence was highly homologous to human collagen type I,and the folding structure was highly similar to that of human collagen type III.The apparent molecular weight was 55-60 kD,yield 36.4 mg/L,purity 95%.The experiments of isoelectric point detection,amino acid composition and circular dichroism combined with advanced structure prediction analysis proved that the physicochemical properties and protein structure were consistent with collagen characteristics.Conclusions The conserved functional structural domain hCol.1 of human type I collagen was successfully expressed in recombinant fusion with peptides such as SUMO,and named as Fuhuo Factor(factor of human thriving and flourishing,FHTFF),the genetically engineered bacterium pET21a(+)-FHTFF/BL21 was screened,and the physicochemical properties,sequences,and structures of the purified product Fuhuo Factor are highly similar to those of human type I and III collagen peptides,and it belongs to the new biomaterials of recombinant humanized collagen.【Key words】Recombinant humanized collagen type;Fuhuo factor;Genetically engineered bacteria胶原蛋白是胞外基质重要组成部分，占人体总蛋白 25%35%，29 个型别中型约占 90%1。天然胶原含多条肽链，具有甘氨酸-X-Y（Gly-X-Y）重复结构，X 和 Y 代表除 Gly 外的其他氨基酸残基，通常是脯氨酸和 4-羟脯氨酸2。天然胶原提取方法中的碱法和热水法易引起蛋白变性及氨基酸消旋，而酸法和酶法提取蛋白分子量范围大，存在酶解不彻底、批间差异大等问题3。天然提取胶原多不可溶，而生物发酵表达也存在包涵体难复溶和折叠错误的缺点4。研究发现泛素相关蛋白应基金项目：中华生物医药创新基金资助项目（No.IFCABM20210606 FLM03）。2 医药前沿 2024年1月 第14卷第1期 论著用于融合表达，可提高目标蛋白表达量、可溶性以及正确折叠5。为提高生物合成胶原蛋白产量和功能，华南理工大学联合中华生物医药研究院通过基因工程技术将SUMO 等肽段与人胶原蛋白 1 链保守片段融合为 His6-SUMO-Col.1 重组基因，命名为福活因子（Fu Huo Tai fution factor,FHTFF）。本研究利用工程菌高密度发酵、分离、纯化获得高纯度福活因子，结构表征实验证明其与人胶原蛋白序列和结构高度同源，属于创新重组人源型胶原蛋白新生物材料。1 资料与方法1.1 材料工程菌 pET21a（+）-FHTFF/BL21 为华南理工大学构建。镍亲和层析琼脂糖凝胶，分析纯化学试剂，国药集团化学试剂有限公司。缓冲液A（Na2HPO4 20 mmol/L，NaCl 0.5 mol/L，pH 7.4），缓冲液B为A+咪唑0.5 mol/L，缓冲液C（Na2HPO4 20 mmol/L，NaCl 0.10 mol/L，pH 7.4），缓冲液D（Na2HPO4 20 mmol/L，NaCl 1.0 mol/L，pH 7.4）。1.2 仪器与设备恒温振荡培养箱（FB-110H-YQA，上海励途机械设备工程有限公司）；50 L 发酵罐（18R029-3，无锡宜欣制药设备厂）；蛋白纯化仪（APPS-50D，利穗科技）；电泳仪（1658034，BIO-RAD 美国），成像仪（FluorChemFC2，ProteinSimple 美国）。1.3 制备方法将测序正确质粒在工程菌 E coli BL21（DE3）50 L发酵系统高密度发酵：pH 6.5 7.2，溶氧 30%60%，温度 30 37。IPTG 0.4 mmol/L 诱导 6 12 h。离心收集菌泥 700 bar 高压均质，10 破碎 5 个循环。10 000 r/min，30 min 收集破碎上清。缓冲液 A 平衡镍柱后上样，60%缓冲液 B 洗脱收集蛋白。过 Sephadex G-25柱置换缓冲液 C，再经 30Q SOURCE 离子交换层析，40%缓冲液 D 洗脱收集得福活因子。1.4 纯度产率分析蛋白浓度采用考马斯亮蓝法检测，牛血清白蛋白参比，595 nm 处吸光度值标准曲线回归方程计算含量。SDS-PAGE 电泳考染后凝胶扫描仪测量纯度。1.5 结构表征检测6 mol/L 盐酸 110 密闭水解福活因子，氨基酸分析仪分析氨基酸组成。按中国药典四部通则 3405“肽图检查法”和 0541“电泳法第六法”进行等电点与肽图分析6。圆二色光谱分析二级结构特征，并与 PSIPRED预 测 对 比7。将 1 g/L 的 样 品 加 到 DSC 样 品 池，5 /min 密封加热 20 200 8。2 结果2.1 测序、纯度与理化分析基因测序证实 hCol.1 成功插入载体且无突变（图1a），LC-MS 质谱蛋白质测序后 Blast 显示，FHTFF 全长肽段与人型胶原蛋白 1 链序列有 98.5%类似，与、型等部分序列也较高类似，与泛素化蛋白 SUMO1 有100%类似性。福活因子理论分子量 46 kD，SDS-PAGE 表观分子量 55 60 kD，可能是因为亲水性氨基酸占比较大（图 1b）。不同批次纯度均值（95.561.6）%，符合医用蛋白纯度 95%要求。延长发酵时间 8 h，产率和纯度均提高（表 1）。圆二色性图谱扫描结果（图 1c）与在线预测胶原蛋白同源序列的二级结构一致，具有自组装特征 195 nm 负峰 221 nm 正峰，其特征-折叠刚性结构与-螺旋结构构成蛋白质整体构象基本骨架，可改善型胶原蛋白纤维强度。等电点分析（图 1d）显示 pI=5.9，接近理论值 5.69。DSC 显示变性温度 Tm 83.07（图 1e），说明分子稳定度高。表 1 蛋白产率与纯度分析表批号时间/h重量/g浓度/（mgmL1）体积/mL产率/（mgL1）纯度/%167600.308008.6493.89281 0000.351 00013.4495.663121 8000.501 50029.1297.11（a）（b）（c）（d）（e）注：（a）pET21a（+）-SUMO-Col.1（FHTFF）序列对比（部分）；（b）FHTFF 电泳纯度；（c）FHTFF 圆二色谱 CD 扫描与二级结构测算；（d）FHTFF 等点聚焦电泳；（e）FHTFF DSC 变性温度分析。图 1 FHTFF 测序、纯度与理化特征医药前沿 2024年1月 第14卷第1期 论著 32.2 氨基酸与肽图分析氨基酸图谱显示福活因子 Gly、Pro、Ala 及 Lys 等含量高（图 2a），符合胶原蛋白富含甘氨酸、脯氨酸等亲水性氨基酸的特性。肽图分析显示福活因子富含短小肽段重复结构，也就是型胶原蛋白 链基序 Gly-X-Y（图 2b）。时间/min时间/min（a）（b）注：（a）氨基酸分析；（b）肽图分析。图 2 FHTFF 氨基酸与肽图分析3 讨论由于天然动物蛋白具有多种潜在风险，通过合成生物学人工合成重组蛋白，如胶原蛋白、乳铁蛋白等，已经成为全球热点9-12。本研究将胶原蛋白保守序列hCOL.1 和不同肽段，通过基因工程技术，以 AI 菌种计算设计优化，构建于特殊表达载体，经高通量筛选和高效表达合成出产量高于 29.12 mg/L，纯度超过 95%的重组融合蛋白，符合医用蛋白纯度要求，命名为“福活因子”，英文 FHTFF。通过基因测序和蛋白质测序比对，证明FHTFF与、等亚型人胶原蛋白1序列高度同源，说明重组蛋白产物一级结构准确，属于重组型人源化胶原蛋白。而高级结构预测显示折叠结构与人型胶原蛋白高度类似，说明 FHTFF 兼具两者的结构特征；肽图分析显示 FHTFF 具有胶原蛋白特征重复基序（G-X-Y），该基序是胶原蛋白高级结构和生物功能的基础，说明FHTFF 具有形成人胶原蛋白高级结构的特性，也就是具有人胶原蛋白的功能；等电点分析提示富含亲水性氨基酸，可增强其亲水性和可溶性，说明 FHTFF 提高了生物相容性和亲水性，增强了胶原蛋白的保水功能；圆二色谱分析确认 FHTFF 在 SUMO 协助下折叠正确13，具有特征峰和天然胶原蛋白三螺旋结构，体现出福活因子作为胶原蛋白的组成成分，参与构成天然胶原蛋白网络结构的潜能。DSC 分析显示变性温度高，分子稳定度高，有利于福活因子在生产、运输和使用过程中的稳定性和安全性维持。FHTFF 分子量大于 1 kDa，不被皮肤黏膜吸收，但因其含有胶原蛋白保守功能细胞黏附基序，可以外源补充方式，如同细胞分泌的胶原蛋白肽那样参与构成胞外基质的胶原蛋白骨架，通过物理吸附细胞表面电荷，提供胞外糖基化蛋白等大分子的铆定位点，为细胞提供外部支撑，促进损伤部位胞外基质骨架的重构与修复14。同时，FHTFF 含有大量亲水氨基酸，提高了亲水性，从而促进皮肤或上皮黏膜的水分保持。华南理工大学与中华生物医药研究院联合进行的“福活因子”合成生物学研究，探索了重组型人源化胶原蛋白（福活因子）的理化特征，证实这种创新融合表达的胶原蛋白，兼具 I/III 型人胶原蛋白保守序列的理化特性，还提高了亲水性、稳定性和安全性。为重组人源化胶原蛋白的工业化生产提供了可行的思路，为胶原蛋白的优化改造提供了有益的探索，为医药健康领域提供了优质的新生物材料。本研究在福活因子的功能方面还有不足，后续将持续进行其生物学功能的研究，而基于福活因子衍生的型胶原凝胶敷料，也正在上海第七、第十人民医院进行多中心临床试验，观察其对轻度盆底功能障碍的疗效。【参考文献】1 RICARD-BLUM S.The collagen family J/OL.Cold Spring Harb Perspect Biol,2011,3(1):a004978.https:/doi.org/10.1101/cshperspect.a004978.2 SORUSHANOVA A,DELGADO L M,WU Z N,et al.The collagen suprafamily:from biosynthesis to advanced biomaterial development J/OL.Adv Mater,2019,31(1):e1801651.https:/doi.org/10.1002/adma.2018016513 梁健华 胶原蛋白的提取、性质及其应用的研究进展J 现代食品，2021(16):44-49.（下转第 7 页）医药前沿 2024年1月 第14卷第1期 论著 712 朱云霞，杨璨，陈媛媛，等恶性肿瘤患者口服营养补充实施与管理的证据总结 J中华现代护理杂志，2020,26(33):4623-4629.13 DE LAS PEAS R,MAJEM M,PEREZ-ALTOZANO J,et al.SEOM clinical guidelines on nutrition in cancer patients(2018)J.Clin Transl Oncol,2019,21(1):87-93.14 WEIMANN A,BRAGA M,CARLI F,et al.ESPEN practical guideline:clinical nutrition in surgery J.Clin Nutr,2021,40(7):4745-4761.15 吴国豪，谈善军胃肠外科患者围手术期全程营养管理中国专家共识（2021 版）J中国实用外科杂志，2021,41(10):1111-1125.16 GUSTAFSSON U O,SCOTT M J,HUBNER M,et al.Guidelines for perioperative care in elective colorectal surgery:enhanced recovery after surgery(ERAS）society recommendations:2018 J.World J Surg,2019,43(3):659-695.17 中国加速康复外科专家组中国加速康复外科围手术期管理专家共识（2016）J中华外科杂志，2016,54(6):413-418.18 王少华，路遥，李曼林，等基于循证的围术期护理在腹腔镜下结直肠癌根治术中的应用 J中华全科医学，2020,18(2):325-328.19 陈玲，王雪丰，王潇烽，等预康复理念在老年消化道肿瘤手术患者中的应用进展 J现代实用医学，2021,33(7):971-972.20 闫新雍术前预康复在老年腹腔镜结直肠癌手术中的应用 J中国老年学杂志，2021,41(11):2298-2300.21 秦珮珮，金菊英，闵苏，等术前快速康复操对腹腔镜结直肠癌根治术后恢复的影响 J临床麻醉学杂志，2021,37(2):119-122.22 TRPANIER M,MINNELLA EM,PARADIS T,et al.Improved Disease-free Survival After Prehabilitation for Colorectal Cancer SurgeryJ.Annals of Surgery,2019,270(3):493-501.23 TIAN W L,XU X,YAO Z,et al.Early enteral nutrition could reduce risk of recurrent leakage after definitive resection of anastomotic leakage after colorectal cancer surgery J.World J Surg,2021,45(1):320-330.24 LI L,LIU L L,KANG H L,et al.The influence of predictive nursing on the emotions and self-management abilities of post-colostomy rectal cancer patients J.Am J Transl Res,2021,13(6):6543-6551.25 范严君，王建新，申丽香量化评估策略干预下的护理在胃癌术后患者预后中的应用 J齐鲁护理杂志，2021,27(17):71-73.26 AL-ARIFI M N,AL-OMAR H A.Impact of a multidisciplinary intensive education program on type 2 diabetes mellitus patients glycemic control and cardiovascular risk factors J.Saudi Med J,2018,39(7):705-710.27 HARIS,POLNER K.Care for chronic renal patients-Role of multidisciplinary education J.Physiol Int,2018,105(4):347-357.（上接第 3 页）4 FERTALA A.Three decades of research on recombinant collagens:reinventing the wheel or developing new biomedical products?J.Bioengineering,2020,7(4):155.5 MALAKHOV M P,MATTERN M R,MALAKHOVA O A,et al.SUMO fusions and SUMO-specific protease for efficient expression and purification of proteins J.J Struct Funct Genomics,2004,5（1/2）:75-86.6 国家药典委员会，中国药典：四部S 北京：中国医药科技出版社2020:72-75,317-319.7 史新昌，饶春明，裴德宁，等重组人干扰素-2a(IFN-2a)的圆二色谱分析 J药物分析杂志，2005,25(10):1169-1172.8 JOHNSON C M.Differential scanning calorimetry as a tool for protein folding and stability J.Arch Biochem Biophys,2013,531（1/2）:100-109.9 YU K,LIU C C,KIM B G,et al.Synthetic fusion protein design and applications J.Biotechnol Adv,2015,33(1):155-164.10 ZARZHITSKY S,JIANG A,STANLEY E E,et al.Harnessing synthetic biology to enhance heterologous protein expression J.Protein Sci,2020,29(8):1698-1706.11 ZHAO Z L,DENG J J,FAN D D.Green biomanufacturing in recombinant collagen biosynthesis:trends and selection in various expression systems J.Biomater Sci,2023,11(16):5439-5461.12 王勇，全冰华，方伟，等重组牛乳铁蛋白（融合因子）作为新生物材料的安全性评价分析 J中文科技期刊数据库（全文版）自然科学，2023(10):110-114.13 PEROUTKA III R J,ORCUTT S J,STRICKLER J E,et al.SUMO fusion technology for enhanced protein expression and purification in prokaryotes and eukaryotes J.Methods Mol Biol,2011,705:15-30.14 BANERJEE P,SHANTHI C.Cryptic peptides from collagen:a critical review J.Protein Pept Lett,2016,23(7):664-672.