LncRNA HAGLR激活RUNX2并抑制NLRP3炎症小体对胫骨骨折愈合的影响.pdf
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1、830安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y;58(5)网络出版时间:2023-04-21 11:18:52 网络出版地址:h t t ps:/k n s.c n k i.n et/k c ms/d et a il/34.1065.R.20230420.1341.021.h t mlLncRNA HAGLR 激活 RUNX2并抑制NLRP3炎症小体对胫骨骨折愈合的影响王 文,陈新宇,黄兹艺,邓杨柳,崔红旺摘要 目的 研究长链非编码RNA(Ln c RNA)HAGLR对胫 骨骨折(IT)小鼠的NOD样受体蛋白3(NLRP 3
2、)炎症小体表 达和骨折愈合的影响并探讨机制。方法体外对成骨细胞 MC3T3-E1沉默HAGLR,CCK-8法检测细胞活力,TUNEL法 检测细胞凋亡,q P CR法检测骨碱性磷酸酶(BALP)和骨钙素 的表达。West er n bl o t法检测RUNX2、磷酸化RUNX2(p-RUNX2)以及NLRP 3、半胱天冬酶1(Ca spa sel)、凋亡相关斑 点样蛋白(ASC)、白细胞介素-ip(IL-ip)的表达。通过小鼠 TF手术建立TF小鼠模型,在模型小鼠体内过表达HAGLR,并在过表达HAGLR的基础上沉默RUNX2或加入炎症小体 抑制剂MCC950。q P CR法检测HAGLR和RU
3、NX2的表达,West er n bl o t法检测胰岛素样生长因子-1(IGF-1)的表达。mic r o CT测量小鼠骨痂体积(MBV),称量小鼠的全长胫骨湿 重。结果 沉默HAGLR导致MC3T3-E1细胞活力降低且凋 亡率增加(P 0.05),且RUNX2.p-RUNX2.BALP和骨钙素 表达量均降低(P 0.05),NLRP 3、Ca spa sel、ASC、IL-10 的表 达量都增加(P 0.05)。与健康组织比较,TF小鼠体内HA-GLR和RUNX2表达量降低(P 0.05)。过表达HAGLR促 进TF小鼠体内的HAGLR和RUNX2表达,并增加MBV和 全长胫骨湿重以及IG
4、F-1的表达量(P 0.05)。在过表达 HAGLR的基础上沉默RUNX2导致TF小鼠的MBV、全长胫 骨湿重和IGF-1表达量都降低(P 0.05)。而在过表达HAGLR 的基础上加入NLRP 3炎症小体抑制剂MCC950导致 MBV、全长胫骨湿重和IGF-1表达又增加(P 0.05)o结论Ln c RNA HAGLR通过激活RUNX2并抑制NLRP 3炎症小 体促进TF的愈合。关键词 胫骨骨折;同源框D基因簇反义生长相关的长非 编码RNA;Ru n t相关转录因子2;NOD样受体热蛋白结构域 相关蛋白3;炎症小体中图分类号R683文献标志码A 文章编号1000-1492(2023)05-0
5、830-08 d o i:10.19405/j.c n k i.issn l OOO-1492.2023.05.021骨折愈合是一个复杂且漫长的过程,多种生长2022-11-20 接收基金项目:国家自然科学基金(编号=81760260)作者单位:海南医学院第一附属医院急诊和创伤外科,海口 570100 作者简介:王文,男,主治医师;崔红旺,男,博士,副主任医师,责任作者,E-ma il:c q c h w 2013 sin a.c o m因子和细胞炎症因子参与骨折的愈合过程,负责调 节细胞活化和成骨细胞增殖1-3o研究发现,NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-l ik e r ec e
6、pt o r py r in d o ma in-a sso c ia t ed pr o t ein 3,NRLP 3)炎症 小体不仅能激活炎症反应而且还参与了骨质疏松进 展的调控,在延迟骨折愈合的过程中扮演重要角色。然而,其上下游的调控机制并不清楚。长非编码 RNA(l o n g n o n-c o d in g RNA,Ln c RNA)是一类大于 200个核昔酸的非编码转录本家族,通过调节 Ru n t 相关转录因子 2(r u n t-r el a t ed t r a n sc r ipt io n f a c t o r 2,RUNX2)和炎症小体密切参与骨折愈合的调 控6-8
7、0同源框D基因簇反义生长相关的长非编 码 RNA(h o meo bo x D g en e c l u st er a n t isen se g r o w t h-a sso c ia t ed l o n g n o n c o d in g RNA,HAGLR)是一种关键的 Ln c RNA9-11 0已知HAGLR在股骨颈骨折中表达 降低问,但对胫骨骨折(t ibia l f r a c t u r e,TF)的调控作 用仍不清楚。该研究拟建立TF模型,探讨HAGLR 对骨折的愈合作用和机制。1材料与方法11材料1.1.1 主要试剂 小鼠成骨细胞MC3T3-E1购于 武汉普诺赛生命
8、科技有限公司。DMEM培养基购 于美国GIBCO公司;胎牛血清购于美国Mer c k Mil l i-po r e公司;沉默HAGLR的阴性对照(si-NC)、沉默 HAGLR 的小干扰 RNA 载体(si-HAGLR)、pc D-NA3.1 空载体(pc DNA-n u l l)、pc DNA3.1-HAGLR 过 表达载体(pc DNA-HAGLR)、短发夹RNA载体阴性 对照(sh-NC)、沉默RUNX2的短发夹RNA载体(sh-RUNX2)构建于上海吉玛制药技术有限公司;NL-RP 3炎症小体抑制剂MCC950购于美国MCE公司;Lipo f ec t a min e 2000 购于美
9、国 Th er mo Fish er Sc ien t if ic 公司;CCK-8试剂盒、TUNEL染色试剂盒、RIP A裂 解缓冲液购于上海碧云天生物技术有限公司;TR Izo l 试剂购于美国 Th er mo Fish er Sc ien t if ic 公司;Tr a n sSc r ipt和c DNA合成试剂盒购于天根生化科技(北京)有限公司;Un iv er sa l SYBR Gr een Fa st q P CR 安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y;58(5)831Mix Kit购于美国ABc l o
10、 n a l公司;GAP DH购于美国 Cel l Sig n a l in g Tec h n o l o g y 公司;HRP 标记的亲和山 羊抗兔鼠Ig G(H+L)二抗购于美国P r o t ein Tec h Gr o u p公司;P VDF购于上海碧云天生物技术有限公 司;RUNX2抗、P-RUNX2 一抗、胰岛素样生长因 子-1(in su l in-l ik e g r o w t h f a c t o r-1,IGF-1)抗购于美 国 Cel l Sig n a l in g Tec h n o l o g y 公司;NLRP 3、Ca spa sel、ASC、白细胞介素-
11、1 p(in t er l eu k in-10,IL-1 p)的一抗 购于北京生工生物工程有限公司。1.1.2实验动物100只成年雄性C57BL/6小鼠,10周龄,体质量(31.25 1.66)g,购于海南药物研 究所有限责任公司(许可证号:SCXK2020-0007)。所有小鼠均在受控温度(21 23 C)下喂养,12 h/12 h光/暗周期模拟白天/夜晚变化,并自由获取食 物和水。本研究中使用的所有动物都按照机构动物 护理指南接受了人道护理。所有手术和实验程序均 通过海南医学院第一附属医院伦理委员会批准。12方法12.1动物分组与建模 TF小鼠建模方法按文 献提供的方法,用1%戊巴比妥钠
12、按1 ml/k g腹 腔注射麻醉小鼠后,备皮、消毒小鼠右下肢,在小鼠 右侧膝关节下切开约0.5 c m纵行切口,由膑腱处插 入22 G/0.41 mm髓内固定针,于胫骨中上1/3处 分离肌肉及筋膜,使用锯片锯断胫骨骨干后立即使 用0.9%生理盐水冲洗胫骨表面,再将髓内固定针 完全插入并对合。逐层缝合切口,制成TF模型小 鼠。将20只小鼠按随机数表法分为健康组(No r ma l 组,正常饲养,=10)和TF组5=10)。另,将80 只雄性C57BL/6小鼠在TF术后10 d,随机分为8 组进行治疗:pc DNA-n u l l+TF 组pc DNA-n u l l 以 20 jJLg/(k g
13、 d)静脉注射;pc DNA-HAGLR+TF 组 pc DNA-HAGLR 以 20|x g/(k g-d)静脉注射;sh-NC+TF 组sh-NC以20|x g/(k gd)静脉注射;sh-RUNX2+TF 组sh-RUNX2 以 20k g d)静 脉注射;sh-NC+pc DNA-HAGLR+TF 组sh-NC 以 20|x g/(k g d)静脉注射,pc DNA-HAGLR 以 20|x g/(k g-d)静脉注射;sh-RUNX2+pc DNA-HA-GLR+TF 组sh-RUNX2 以 20 jjLg/(k g-d)静脉注 射,pc DNA-HAGLR 以 20 jig/(k
14、g d)静脉注射;sa l in e+pc DNA-HAGLR+TF 组联合注射,其中 sa-l in e 以 100|x l/(k g d)静脉注射,pc DNA-HAGLR 以 20|ig/(k g d)静脉注射;MCC950+pc DNA-HAGLR+TF组联合注射:MCC950以20 mg 100 jjJ/(k g d)静脉注射,pc DNA-HAGLR 以 20 jx g/(k g-d)静脉注射。每组10只小鼠,连续注射4 周后分离全长胫骨并称湿重。随后将各组小鼠的胫 骨组织保存于-80七冰箱中。1.2.2 MC3T3-E1细胞培养 使用含10%胎牛血 清和1%青-链霉素的DMEM培
15、养基在37咒下,含 95%空气和5%C02的培养箱中培养MC3T3-E1细 胞。细胞每2d换液一次,取处于对数生长期的细 胞用于后续实验。1.2.3 MC3T3-E1 细胞转染 si-HAGLR 采用 Lipof ec t a min e 2000 将 10 n mo l/L si-NC 或 si-HAGLR 转 染入MC3T3-E1细胞中。24 h后收集细胞用于 q P CR检测。1.2.4 q P CR 检测 HAGLR、BALP、骨钙素和 RUNX2的表达 收集si-NC组和si-HAGLR组细胞 用于检测HAGLR、骨碱性磷酸酶(bo n e a l k a l in e ph o s
16、ph a t a se,BALP)、骨钙素的表达。收集 No r ma l 组、TF 组、pc DNA-n u l l+TF 组、pc DNA-HAGLR+TF 组、sh-NC+TF 组、sh-RUNX2+TF 组、sh-NC+pc DNA-HAGLR+TF 组、sh-RUNX2+pc DNA-HAGLR+TF组骨组织(用于检测HAGLR和RUNX2的表达,骨组织研磨后浸入液氮粉化)。使用Tr izo l法提取 待测组织或细胞的总RNA。用DNa se I处理1趕 总RNA,进行逆转录。并根据制造商的说明,使用 SYBR Gr een P CR 进行 q P CR 分析。q P CR 引物序
17、列见表1。在96孔光学反应板中进行40个循环进 行扩增,1个循环中94 C变性5 s,63 C退火30 s,72 C延伸60 so以GAP DH作内参基0,2*法 计算分析目的基因的表达水平。表1 qPCR引物序列基因引物序列(5,-3,)HAGLRF:TCTGAAAGAAGGACCAAAGTAAR:ATTCAAGGGACAGTCACAGGBALPF:TTAGTCCGGTITAGAAAGGTR:TTGGAAGTAAAGCCCCTGGAo st eo c a l c inF:GTGTGGTGTATGTGGTCCR:CCCCTTAGAGAGGTGTGRUNX2F:TCGAAAGCATGAAGGAC
18、AACG R:AGCACTCAGTCAACGTCTCACGAP DHF:GAGTATGTGATITATGGTAAGR:AGATGTAGTATTAGTAGTATT1.2.5 CCK-8检测MC3T3-E1细胞的增殖 根据 生产商提供的说明,将转染si-NC或si-HAGLR的 MC3T3-E1细胞接种至96孔板中,培养24、48、72、96 h后去除培养液,在避光下向每孔加入100以含832安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y;58(5)10%CCK-8溶液的DMEM完全培养液,37龙孵育4 h后终止培养,室温下置于摇床振
19、荡5 mino在酶标 仪上测定450 n m处吸光度值。实验重复3次。1.2.6 TUNEL检测MC3T3-E1细胞的凋亡 根据 生产商提供的说明,于细胞爬片上培养MC3T3-E1 细胞并转染si-NC或si-HAGLR,培养24 h后去除培 养液,在避光下向每孔加入50|x l TUNEL试剂盒工 作液,并继续孵育12 ho DAP I核染15 min后加入 抗荧光淬灭液封片,荧光显微镜上观察拍照。细胞 凋亡率=TUNEL阳性细胞/总细胞x 100%。1.2.7 West er n bl o t 检测 RUNX2 和 NLRP 3 炎症小 体相关蛋白的表达收集各组细胞和各组小鼠股骨 组织,将
20、组织匀浆后,在冰上于RIP A裂解缓冲液中 裂解细胞和组织。BCA法测定细胞与组织中的蛋 白浓度。取50 jig蛋白样品,SDS-P AGE凝胶进行 分离。随后,转移蛋白到P VDF上。将P VDF膜用 5%脱脂奶粉封闭后,加入RUNX2和p-RUNX2.NL-RP 3、Ca spa sel、ASC、IL-1|3、IGF-1 抗,并在在 4 V 下孵育过夜。次日,加入HRP标记二抗在室温下孵 育2h。随后用增强的化学发光试剂显色,并使用 Ima g e J软件进行分析。1.2.8 微计算机断层扫描(mic r o-c o mpu t ed t o mog r a ph y,mic r o-CT
21、)测量小鼠骨痂骨体积(mo u se bo n e v o l u me,MBV)近端干聽端区域内的骨形态测量使 用mic r o-CT对胫骨进行量化。在背腹方向扫描250 个切片(厚度13 Fx m)o使用三角测量算法进行骨 骼的三维重建。测量小鼠骨痂骨尺寸,并生成MBV 值。1.3统计学处理 采用SP SS 22.0统计软件进行 数据分析。数据采用 s表示,/检验分析两组的 差异,使用单因素方差分析多组间差异,组间两两比 较采用LSD-f检验分。P 0.05为差异有统计学意 义。2结果2.1 TF小鼠骨折组织中HAGLR的表达 图1A 为TF后不同周的TF小鼠的X光片。在第1周和 第2周无
22、骨愈合特征,第4周出现了骨愈合组织和 骨折形态,这表明TF模型小鼠造模成功。q P CR法 检测结果显示:与No r ma l组比较,HAGLR在TF组 小鼠骨组织中表达下调(7.05 1.21)”s(2.61 0.49),t&662,P=0.031,差异有统计学意义,见 图IB。B B蛊眾fe礙善DVH-frDVH-fr番血11周A图1 TF模型观察及骨折组织中HAGLR的表达A:TF小鼠第1、2、4周代表性X光片,箭头指示骨折部位;B:q P CR法检测小鼠骨折组织中HAGLR的表达,与No r ma l组比较:*P 0.052.2 敲低HAGLR诱导小鼠成骨细胞的凋亡和NLRP3炎症小体
23、的表达 q P CR结果显示:与si-NC 组比较,si-HAGLR组MC3T3-E1细胞中HAGLR表 达显著降低(1.00 0.12)vs(0.46 0.03)=13.216,P=0.002,图 2A。CCK-8 实验结果显示:与si-NC组比较,si-HAGLR组MC3T3-E1细胞的增 殖活力明显降低(F=9.662,P=0.014,图2B)。TUNEL染色结果显示:与si-NC组比较,si-HAGLR 组MC3T3-E1细胞的凋亡率显著升高(4.12 0.43)%仍(&51 0.92)%,211.602,P=0.003,图2C)。随后,通过q P CR检测BALP mRNA和骨 钙素
24、mRNA的表达水平来评估HAGLR对成骨细胞 活性的调节作用,结果显示:与si-NC组比较,si-HAGLR 组MC3T3-E1细胞BALP和骨钙素的mRNA水 平均明显下调(BALP:t=15.236,P=0.002;骨钙 素:t=13.251,P=0.003,图 2D、E)o West er n bl o t 检测NLRP 3炎症小体相关蛋白NLRP 3、Ca spa sel、ASCJL-ip表达,结果显示:与si-NC组比较,si-HA-GLR 组 MC3T3-E1 细胞中 NLRP 3、Ca spa sel、ASC、IL-1 B蛋白表达均明显升高(NLRP 3:t=9.503,P=0.
25、035;Ca spa se l:t=15.446,P=0.003;ASC:t=10.305,P=0.007;IL-1 p:z=&528,P=0.022,图 2F J)o2.3 HAGLR 调控 RUNX2 的表达 在 MC3T3-E1 细胞中,与si-NC比较,si-HAGLR组中RUNX2的 mRNA和蛋白水平均显著降低(t=17.089、12.887,P=0.001、0.019,图 3A、B),且 p-RUNX2 蛋白水平 也降低Q=12.007,P=0.008,图3C)。在小鼠骨组 织中,与No r ma l组比较,RUNX2的mRNA在TF组 安徽医科大学学报 Acta Univers
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