制草乌肝毒性效应的代谢通路分析.pdf
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1、云 南 中 医 中 药 杂 志实验研究基金项目:蒙药安全性评价创新团队项目()中央支持地方建设专项资金交叉学科建设项目()自治区高校创新团队项目()内蒙古民族大学博士启动基金项目()科技领军人才和创新团队支持计划创新团队培育项目()第一作者简介:姜艳丽()女在读硕士研究生研究方向:药理及毒理学研究通信作者:白梅荣 :制草乌肝毒性效应的代谢通路分析姜艳丽 图布新 乌日汉 胡伊力格其 刘锦文 韩晓静 阿都沁夫 白梅荣(内蒙古民族大学 内蒙古 通辽 内蒙古医科大学 内蒙古 呼和浩特)摘要:目的 基于代谢组学技术检测制草乌对大鼠肝功能指标及肝组织病理影响从而探究代谢通路分析 方法 以制草乌为示例药物以
2、大鼠为研究对象将大鼠按体重随机分成 组 根据预试验结果设定正常组、制草乌高剂量组、中剂量组、低剂量组 除正常组外其余各给药组灌胃相应的药物溶液 次/连续灌胃 末次给药后收集血清样本检测各组的血清生化指标及采用 非靶向代谢组学技术对血清内源性代谢产物变化进行分析 结果 血清生化指标结果显示与正常组比较制草乌高剂量组 含量显著升高有统计学意义()肝组织病理检测显示正常组肝小叶结构清晰肝细胞索和肝血窦大致呈放射状排列肝细胞圆润、饱满肝板排列规则、整齐 制草乌高剂量组肝细胞广泛水肿、空泡化、丧失结构完整性制草乌中和低剂量组未见明显异常从血清中共筛选出 个内源性差异代谢物其中上调 个、下调 个多数涉及烟
3、酸和多种氨基酸代谢 结论 明确制草乌具有一定的肝毒性肝毒性机制主要与烟酰胺()和 甲基烟酰胺()代谢有关关键词:制草乌肝脏毒性血清代谢通路机制分析中图分类号:文献标志码:文章编号:()(.)【】:.:.:(.).年第 卷第 期云 南 中 医 中 药 杂 志 .:()().【】草乌为毛茛科植物北乌头 的干燥块根 异名为毕哈、曼钦、哈拉、泵那格、哈日泵阿、哈日浩热苏 味辛性温效轻有大毒 功能与主治为杀黏燥协日乌素止痛 主治瘟疫黏痧症急性刺痛黏刺痛黏奇哈痈疖丹毒白喉炭疽瘿瘤黏性脖颈僵直陶赖赫如虎关节疼痛及相讧热肺感冒喉感冒等症 制草乌作为大毒蒙药不合理应用将会对肝脏有毒性影响 肝脏担负着人体代谢、解
4、毒、合成等重要生理功能 不仅是体内药物代谢和排泄的重要场所也是药物毒性反应的易感靶器官 由药物所致急慢性肝功能衰竭呈逐年增高已成为严重制约临床安全用药和药物研发的又一大荆棘 以此不合理应用含有毒味的制草乌亦有一定的肝毒性 血清丙氨酸氨基转移酶()天门冬氨酸氨基转移酶()和碱性磷酸酶()是临床常用的诊断指标其参考区间主要用于帮助临床医生判断就诊者肝功能是否正常 目前尚未见制草乌肝毒性与内源性代谢物相关的研究报道 因此本研究以大鼠为研究对象以制草乌为示例药物探讨制草乌产生肝毒性时从肝功能指标及肝组织病理影响且出现的内源性代谢产物变化规律而探究通路分析为寻求防治制草乌肝毒性的相应靶点及为制草乌临床指
5、导合理应用提供有力的实验依据 实验材料 动物 雄性大鼠 级体重为 由辽宁长生生物技术股份有限公司提供(辽)饲养条件:室温维持 光照 自由饮水、摄食 药品与试剂 制草乌由内蒙古民族大学附属医院蒙药制剂室提供经专家(内蒙古民族大学蒙医药学院药用植物鉴定教研室包桂花教授)鉴定为正品纯化水(屈臣氏集团有限公司)谷丙转氨酶()、谷草转氨酶()、磷酸酶()试剂盒均购自罗氏诊断产品(上海)有限公司 仪器 型移液器(德国 公司)质谱仪 (公司)型台式高速冷冻离心机(公司)型粉碎研磨仪(上海万柏生物科技有限公司)罗氏全自动生化分析仪(上海罗氏诊断产品有限公司)型恒温水浴锅(上海爱郎仪器有限公司)生物显微镜(公司
6、)色谱(岛津 公司)实验方法 草乌溶液的制备取鉴定为正品的制草乌用粉碎研磨仪适量进行粉碎过 目筛用纯化水配制成不同浓度的制草乌给药溶液 给药剂量设置 把临床等效量设为中剂量进行了研究 制草乌高剂量组为临床等效量的 倍量即 /制草乌中剂量组为临床等效量 即 /制草乌低剂量组为临床等效量的/倍量即 /动物分组及取材 动物分组:取 大鼠 只按体重随机分为正常组、制草乌高剂量组、制草乌中剂量组、制草乌低剂量组每组 只 自实验开始给药组给予相应的药物溶液灌胃每日 次连续 正常组灌胃等量生理盐水 取材:末次给药后麻醉动物用采血管从腹主动脉取血使用离心机以/离心 后移液枪分离血清到离心管取部分肝脏组织固定于
7、 甲醛溶液后将血清和其余肝脏部分置于 保存 随后使用 罗氏全自动生化分析仪(上海罗氏诊断产品有限公司)测肝生化指标及生物显微镜检测病理切片分析其肝脏内源性代谢产物 代谢物提取 置 解冻上述分组的血清样本分别取 加入 甲醇震荡提取于 下离心 取上清液过 有机滤膜进样 用 检测分别称取上述分组的肝脏样品 于 管中加入 甲醇使用玻璃研磨器研磨至匀浆 年第 卷第 期云 南 中 医 中 药 杂 志离心()取上清液过 有机滤膜进样 用 检测 检测色谱条件:采用 色谱柱()流动相:乙腈:甲酸水溶液流速 /柱温 进样量 洗脱梯度:质谱参数条件:采用电喷雾电离()正离子和负离子模式进行检测 源条件如下:离子源:
8、离子源:界面加热温度:(正离子)和 (负离子)离子喷雾电压浮动()(正离子)和 (负离子)气帘气压力():质量扫描范围:产物离子扫描范围:产物离子扫描累积时间 扫描累积时间 二级质谱采用 ()获得并采用 模式碰撞能量:去簇电压():数据处理应用 进行统计分析各组生化指标用()表示 组间比较分别采用 检验、秩和检验、单因素方差分析法以 为差异有统计学意义利用 软件将获得的原始数据转换成 格式再导入 软件进行峰信息的提取 使用 数据库进行比对 分析各组样本采用多维分析即 和 法筛选 (或 作为差异代谢物 再使用 分析代谢通路 结果 多元统计分析 血清生化指标检测结果与正常组比较从单个 组 别 观
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