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唑类耐药烟曲霉在江苏不同农田流行特点研究.pdf
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1、论著唑类耐药烟曲霉在江苏不同农田流行特点研究刘晨1 黄瑞2 胡丹阳2 周益花2 陆敏2 邓淑文2 史冬梅1,3(1.济宁市第一人民医院医学真菌实验室,济宁 2 7 2 0 0 0;2.苏州高新区人民医院,苏州 2 1 5 0 0 0;3.济宁市第一人民医院皮肤科,济宁 2 7 2 0 0 0)【摘要】目的 横断面调查江苏地区农田唑类耐药烟曲霉热点环境及流行特点。方法 江苏省苏北和苏南地区共采集6 8份农田土壤标本,通过培养分离烟曲霉菌株,进一步进行体外抗唑类药物敏感实验筛选唑类耐药烟曲霉(a z o l e r e s i s t a n c e A s p e r g i l l u f u
2、 m i g a t u s,R A F)菌株,并对分离的R A F菌株扩增c y p 5 1 A基因鉴定耐药突变表型。结果 6 8份农田土壤标本,共分离获得1 0 6株烟曲霉菌株,3 4株(3 4/1 0 6株,耐药率3 2%)为R A F,其中8株检测到c y p 5 1 A基因突变(7株T R 4 6/Y 1 2 1 F/T 2 8 9 A,1株T R 3 4/L 9 8 H/S 2 9 7 T/F 4 9 5 I),这8株R A F菌株对伊曲康唑、泊沙康唑和伏立康唑同时耐药,均对伏立康唑高度耐药(M I C1 6 m g/L)。其余2 6株R A F菌株未检测到任何c y p 5 1
3、A基因突变;R A F在草莓田地最多(1 6株/3 4株),稻田次之(8株/3 4株);苏北农田R A F检出率高于苏南农田,深层土壤R A F检出率略高于表层土壤。结论 江苏农田R A F菌株检出率高达3 2%,以非c y p 5 1 A基因相关耐药机制为主。草莓大棚田地可能是江苏地区农田R A F产生的潜在热点,建议对农业中使用的杀菌剂进行管理,有助于控制临床上的真菌耐药问题。【关键词】江苏农田;唑类耐药;烟曲霉;流行特点【中图分类号】R 3 7 9.6 【文献标志码】A 【文章编号】1 6 7 3-3 8 2 7(2 0 2 3)1 8-0 5 1 1-0 7S t u d y o n
4、p r e v a l e n c e o f a z o l e r e s i s t a n c e A s p e r g i l l u s f u m i g a t u s i s o l a t e d f r o m d i f f e r e n t a g r i c u l t u r e f i e l d s i n J i a n g s u p r o v i n c eL I U C h e n1,HUANG R u i2,HU D a n y a n g2,Z HOU Y i h u a2,L U M i n2,D E N G S h u w e n2,S
5、H I D o n g m e i1,3(1.L a b o r a t o r y o f M e d i c a l M y c o l o g y,J i n i n g,T h e F i r s t P e o p l es H o s p i t a l,J i n i n g 2 7 2 0 0 0,C h i n a;2.T h e P e o p l es H o s p i t a l o f S u z h o u N e w D i s t r i c t,S u z h o u 2 1 5 0 0 0,C h i n a;3.D e p a r t m e n t o
6、 f D e r m a t o l o g y,J i n i n g,T h e F i r s t P e o p l es H o s p i t a l,J i-n i n g 2 7 2 0 0 0,C h i n a)【A b s t r a c t】O b j e c t i v e W e c o n d u c t e d a c r o s s-s e c t i o n a l s t u d y t o i n v e s t i g a t e h o t s p o t s e n v i r o n m e n t a n d p r e v a l e n c
7、 e o f a z o l e-r e-s i s t a n c e A s p e r g i l l u s f u m i g a t u s(R A F)i s o l a t e s f r o m a g r i c u l t u r e f i e l d s i n J i a n g s u p r o v i n c e.M e t h o d s S i x t y-e i g h t s o i l s a m p l e s w e r e t a k e d i n n o r t h a n d s o u t h a r e a i n J i a n g
8、 s u p r o v i n c e,A z o l e-r e s i s t a n t A.f u m i g a t u s w e r e s c r e e n e d b y s e l e c t i v e m e d i u m a n d a n t i f u n g a l s u s c e p t i b i l i t y t e s t,c y p 5 1 A g e n e w e r e a m p l i f i e d f o r d e t e c t i o n o f r e s i s t a n t m u t a t i o n.R e
9、 s u l t s O f 1 0 6 A.f u-m i g a t u s i s o l a t e s r e c o v e r e d f r o m 6 8 s o i l s a m p l e s,3 4(3 2%)w e r e a z o l e r e s i s t a n t A.f u m i g a t u s.E i g h t o f 3 4 h a d m u t a t i o n s i n c y p 5 1 A g e n e(7 T R 4 6/Y 1 2 1 F/T 2 8 9 A,1 T R 3 4/L 9 8 H/S 2 9 7 T/F
10、4 9 5 I),t h e e i g h t i s o l a t e s w e r e m u l t i-r e s i s t a n t t o i t r a c o n-a z o l e,v o r i c o n a z o l e a n d p o s a c o n a z o l e,a n d h a v e M I C1 6 m g/L t o v o r i c o n a z o l e.H o w e v e r,r e s t o f 2 6 R A F i s o l a t e s w e r e n o t d e t e c t e d a
11、n y m u t a t i o n i n c y p 5 1 A g e n e.S t r a w b e r r y f i e l d s w e r e d e t e c t e d t h e m o s t f r e q u e n t l y R A F i s o l a t e s(1 6 i n 3 4 i s o l a t e s),f o l l o w e d b y r i c e f i e l d s(8 i n 3 4 i s o l a t e s).R A F i s o l a t e s i n n o r t h J i a n g s
12、u w e r e d e t e c t e d m o r e f r e q u e n t l y t h a n t h o s e i n s o u t h J i a n g s u.R A F i s o l a t e s f r o m d e e p e r s o i l w e r e s l i g h t l y m o r e t h a n t h o s e f r o m s u p e r f i c i a l s o i l.C o n c l u s i o n O u r s t u d y r e s u l t s s u g g e s
13、t s t h a t d e t e c t i o n r a t e o f R A F i s o l a t e s i n s o i l s a m p l e s i n J i a n g s u a g r i c u l t u r a l f i e l d s w a s u p t o 3 2%,a z o l e-r e s i s t a n c e m e c h a n i s m o f A.f u m i g a t u s w e r e m a i n l y n o n-c y p 5 1 A g e n e r e l a t e d m e c
14、 h a n i s m,S t r a w b e r r y f i e l d s m i g h t b e a p o t e n t i a l h o t s p o t s f o r R A F.M a n a g i n g t h e f u n g i c i d e s u s e d i n a g r i c u l t u r e w i l l h e l p t o c o n t r o l t h e e m e r g e n c e o f a n t i f u n g a l d r u g r e s i s t-a n c e i n c l
15、 i n i c s.基金项目:国 家 自 然 科 学 基 金 面 上 项 目(NM 8 2 2 7 2 3 5 8);苏 州 市 科 技 计 划 项 目(S KY 2 0 2 2 0 3 7);苏 州 高 新 区 人 民 医 院 院 管 课 题(S G Y 2 0 1 9 D 0 2,S GY 2 0 2 1 H 0 1,S G Y 2 0 2 1 C 0 1)作者简介:刘晨,男(汉族),本科,科研助理.E-m a i l:l i u c h e n 0 a a a 1 6 3.c o m;黄瑞,女(汉族),硕士,主治医师.E-m a i l:2 5 8 4 6 4 3 0 6q q.c o
16、 m通信作者:史冬梅,E-m a i l:s h i d o n g m e i 2 81 6 3.c o m;邓淑文,E-m a i l:d a n y a n g h h h q q.c o m115 中国真菌学杂志 2 0 2 3年1 2月 第1 8卷 第6期 C h i n J M y c o l,D e c e m b e r 2 0 2 3,V o l 1 8,N o.6【K e y w o r d s】a g r i c u l t u r a l f i e l d s i n J i a n g s u p r o v i n c e;a z o l e-r e s i s
17、t a n c e;A s p e r g i l l u s f u m i g a t u s;p r e v a l e n c eC h i n J M y c o l,2 0 2 3,1 8(6):5 1 1-5 1 7 烟曲霉(A.f u m i g a t u s)是一种广泛分布的腐生性丝状真菌,是机会性真菌感染的重要病原菌之一,其所致临床疾病谱多样,包括过敏、慢性感染及急性侵袭性曲霉病1。最近报道另一类高危人群,即病毒性肺炎患者易引起曲霉感染2,如重症C O-V I D-1 9肺炎患者易于合并曲霉感染3,并已经报道C O V I D-1 9相关的唑类耐药曲霉感染加速肺炎的恶化4
18、。侵袭性曲霉病危及生命,死亡率高达6 0%5。唑类抗真菌药是治疗和预防曲霉感染的一线药物选择6。然而,全球范围烟曲霉对唑类药物耐药不断增加,部分国家的局部地区可达2 7.8%7。而唑类耐药曲霉感染死亡率是唑类敏感曲霉感染患者死亡率的34倍8。因此,烟曲霉唑类耐药已经成为曲霉感染治疗的一个巨大挑战。目前研究认为9:烟曲霉唑类耐药可在患者接受唑类治疗过程中出现(患者途径);而环境中唑类化合物的广泛使用是烟曲霉唑类耐药选择的主要途径(环境途径)。在中国,唑类杀菌剂的使用量占所有杀菌剂的三分之一以上,国内已经有学者报道浙江、云南等地区农田环境中唑类耐药烟曲霉的流行特点及与农药的相关性1 0-1 2。本
19、研究调查了江苏省部分地区农田分离唑类耐药烟曲霉流行特点,为烟曲霉感染的防治提供科学依据。1 材料和方法1.1 农田土壤样本的采集2 0 1 9年78月间,在江苏省位于苏北的高邮和泰州,苏南的东山和同里古镇的农田和温室大棚采集了6 8份土壤标本,包括水稻、水果、草莓和蔬菜大棚田地的土壤,每个采集点采集深度包括表层下5 c m(表层土壤)和表层下2 0 c m(深层土壤)。1.2 烟曲霉菌株的分离与鉴定每份土壤标本取2 g土壤加入1 5 m L离心管,加入含1%吐温2 0的无菌生理盐水中,定容至1 0 m L后,取涡旋均匀后的菌悬液取1 0 0 L接种含氯霉素(5 0 m g/L)的 沙 堡 弱
20、葡 萄 糖 琼 脂(S a b-o u r a u d d e x t r o s e a g a r,S D A)上,在4 4 培养箱中孵育2 4 h和4 8 h后挑取曲霉菌落,通过显微和肉眼观察并随机选择同一平板上5个具有烟曲霉形态的菌落进行进一步分离鉴定。如果一个平板上的曲霉菌落总数1 m g/L(E C V);泊沙康唑,M I C 0.5 m g/L(E C V)判定为非野生烟曲霉菌株,即唑类耐药烟曲霉菌株。1.4 唑类耐药烟曲霉菌株c y p 5 1 A基因测序所有唑类耐药烟曲霉菌株进行c y p 5 1 A基因及其启动子的扩增测序。基因组D NA提取同菌种鉴定1 5,引物参见前期文
21、献1 6。获得序列采用C l u s t a l W软件,与烟曲霉敏感菌株A F 3 3 8 6 5 9基因序列比,鉴定烟曲霉在c y p 5 1 A基因区域的耐药突变基因。2 结 果2.1 农田土壤标本中唑类耐药烟曲霉菌株检测采集6 8份土壤标本分离培养,3 8份土壤标本曲霉培养阳性,分离1 0 6株曲霉菌株分子鉴定(I T S215 中国真菌学杂志 2 0 2 3年1 2月 第1 8卷 第6期 C h i n J M y c o l,D e c e m b e r 2 0 2 3,V o l 1 8,N o.6 基因)为烟曲霉,其中,7 0株分离自表层土壤,3 6株分离自深层土壤。草莓田烟
22、曲霉分离率最高(3 3株/1 0 6株,3 1%),且1 6株为R A F菌株(耐药率4 8.5%);稻田次之(3 2株/1 0 6株,3 0%),8株R A F菌株(耐药率2 5%),见表1。不同地方分离烟曲霉菌株分别为:高邮2 6株;泰州1 9株;苏州东山3 3株;苏州同里2 8株,见表2。2.2 农田土壤分离唑类耐药烟曲霉菌株特点表2归纳了不同地方分离唑类耐药烟曲霉菌株对三种唑类药物耐药率。表3总结了R A F菌株的环境分布,对三种唑类药物的M I C值及c y p 5 1 A基因突变表型。共分离3 4株唑类耐药烟曲霉菌株(R A F),全部R A F菌株对伊曲康唑耐药(M I C:21
23、 6 m g/L);1 9个菌株对伏立康唑(VO R)耐药(M I C:21 6 m g/L);1 6个菌株对泊沙康唑耐药(M I C:0.51 6 m g/L);I T R+VO R 同时耐药的4株;I T R+P O S同时耐药的1株;I T R+VO R+P O S同时耐药的1 5株,参 见 表2、3。所 有3 4株R A F菌 株 进 行c y p 5 1 A基因及启动子区域扩增,序列分析显示只有8株检测到c y p 5 1 A基因及启动子区域突变;其中,7株含有T R 4 6/Y 1 2 1 F/T 2 9 8 A突变,1株为T R 3 4/L 9 8 H/S 2 9 7 T/F 4
24、 9 5 I突变,其余2 6株R A F菌株没有检测到任何c y p 5 1 A基因及启动子区域突变。8株具有c y p 5 1 A基因突变表型菌株均表现为对检测的三种唑类抗真菌药同时耐药。表1 唑类耐药烟曲霉菌株在不同农田的分布T a b.1 D i s t r i b u t i o n o f a z o l e-r e s i s t a n t A s p e r g i l l u s f u m i g a t u s i s o l a t e s i n d i f f e r e n t f i e l d s农田作物种类采样深度标本数量含烟曲霉的土壤标本数烟曲霉菌株数耐药
25、烟曲霉菌株数耐药率草莓田5 c m872 183 8.1 0%2 0 c m441 286 6.6 7%稻田5 c m1 41 02 252 2.7 3%2 0 c m1 241 033 0.0 0%小白菜田5 c m33524 0.0 0%2 0 c m22326 6.6 7%蔬菜田5 c m62611 6.6 7%2 0 c m41111 0 0.0 0%萝卜田5 c m115002 0 c m11524 0.0 0%桃树5 c m11524 0.0 0%2 0 c m11400毛豆田5 c m111002 0 c m10000韭菜田5 c m201002 0 c m10000大蒜田5 c
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