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一种利用蜜糖废水产生PHA的侧流工艺的建立方法
摘要
试验建立了一种利用蜜糖废水生产聚羟基烷酸脂（PHA）的三阶段过程。该过程包括（1）糖蜜废水酸酵解，（2）PHA富集菌的筛选，（3）利用富集完毕的污泥和酵解之后的糖蜜废水批次累积PHA。在发酵阶段，试验评估了PH（5~7）对有机酸型体分布以及产率的影响。PH较高时乙酸和丙酸为主要产物，然而较低的PH值有利于丙酸和戊酸的产生。试验评估了利用乙酸盐和发酵糖蜜废水为基质筛选的两类菌群的PHA积累能力。考察了有机酸型体分布对利用醋酸盐筛选菌群产生的多聚体的组成以及产率的影响。PHA富集产率在0.37到0.50CmmolHA/Cmmol VFA之间变化。试验观察到了被利用有机酸的类型和多聚物成分的一种直接关系。在糖蜜废水中，低氨氮浓度（0.1Nmmol/l）促进了PHA的储存（0.59 Cmmol HA/Cmmol VFA）。此外，试验建立了一种控制反应器运行利用发酵糖蜜废水筛选PHA富集菌群的方法。利用高有机负荷以及低氨氮浓度选择了一种具有稳定储存PHA能力的菌群，富集产率达到0.59Cmmol HA/Cmmol VFA)，这一能力与醋酸盐筛选菌相似。

前言
聚羟基烷酸脂被认为是优良的可生物降解塑料的候选者。这类含有多种单体组分具有热塑性的多聚物是被细菌作为能量和碳储存物质的。它们的结构特性与聚丙烯的结构性质一致，同时又具有诸多优势：可生物降解、可生物相容、能进一步由可再生碳源产生从而使可持续生产过程成为可能。
然而，PHAs与石化工业衍生的塑料制品在成本上相当大的差异成了这类高聚物部分替代后者的阻碍。目前，商业可行的PHAs是由纯菌（野生的和基因重组的菌种）和纯底物（通常很昂贵）工业化生产而来。PHAs的价格主要取决于底物成本，约占总成本的40%（Choi和Lee，1997）。最近十年来，一系列低成本的碳源基质（例如淀粉、木薯粉水解物、乳清和蜜糖）在纯菌生产PHA过程中得到检验。但是，PHA的生产成本仍然很高，这主要由投资成本和运行成本引起的。
有许多旨在建立更具有成本效益的产PHA工艺的尝试，其中包括混合菌群产PHA工艺。混合菌群是一类未知组成的微生物群体，这类群体是由强加于生物系统之上的运行条件选择而来。此工艺无需灭菌，因此节省了能源和设备成本。混合菌群在瞬时碳源供给的条件下开始储存PHA（Majone等，1996；Van loosdrecht等，1997），瞬时碳源供给指的是feast—famine或者好氧动态投料（ADF），这种方式导致一种非平衡的细胞增长。在碳源过剩阶段，外部的基质被摄取转化为多聚体在细胞内部储存。当底物耗尽，积累的多聚物就会作为细胞生长和维持的能量与碳源。
不同于纯菌培养的是，混合菌群不会将碳水化合物作为PHAs储存而是作为糖原储存（Dricks等，2001）。然而，可挥发性脂肪酸可以被混合菌群转化为PHAs储存。已有许多研究试验了利用合成有机酸由混合菌群生产PHA(例如，醋酸、丙酸、丁酸和戊酸)。(Beccari等，2002；Dionisi等，2004；Serafim等，2004；Lemos等，2006)。Serafim等（2004）发现：在动态补料条件下，利用乙酸盐作为碳源的混合菌群可以积累含量相当于细胞干重65%的PHB。由混合菌群利用废料或低成本基质生产PHA的研究只有极少数报道（RHu 等，2003；Dionisi等，2005；Bengtsson等，2007）。由富含碳水化合物的基质合成PHA需要一个将基质中糖分转化为VFA的预前厌氧发酵步骤。
在混合菌群合成PHA的诸多挑战中，其中一个是细菌的筛选。选择一个具有高效稳定富集PHA能力的菌群对此工艺的效果具有重要作用。几乎所有关于混菌合成PHA的研究都将细菌筛选和PHA富集分别作为两个阶段来运行（Dionisi等，2004；Serafim等，2004；Lemos等，2006）。仅有少数研究报道了三阶段合成工艺的使用，在这种工艺当中在菌种筛选和PHA富集之前增加了厌氧发酵阶段。Dionisi等在2005年提出利用橄榄油制造厂废水（OME）合成PHA的工艺，在此工艺当中PHA富集菌由合成有机酸混合物筛选而来，随后利用发酵之后的OME和筛选菌群批次合成PHA。Bengtsson等在2007年提出利用造纸废水合成PHA的三阶段工艺，包括造纸废水的发酵、利用发酵废水筛选菌群、利用发酵废水和筛选菌群合成PHA三个连续的步骤。但是，尚不清楚哪一种筛选方法顾及到了提高工艺的PHA产率和产量的问题。
本试验研究了利用蜜糖废水（一种蔗糖提炼厂的副产物，具有很高的含糖量，约为干重的50%）由混合微生物菌群合成PHA的工艺。试验使用了三阶段工艺，包括连续三个过程：（1）糖蜜废水酸化降解，（2）在充盈—饥饿状态下筛选PHA富集菌，（3）利用筛选菌群和发酵糖蜜废水批次富集PHA。试验使用了两种不同的方法：利用合成基质（乙酸盐）进行细菌筛选利用发酵糖蜜废水进行富集或者使用发酵糖蜜废水作为两阶段的原料。试验使用以醋酸盐为基质筛选的菌群考察了酸化酵解阶段的PH对多聚物储存产量和单体组成的影响。试验建立了一种利用发酵糖蜜废水筛选PHA富集菌的反应器运行方法。
2. 试验材料和研究方法
2.1备料
本试验使用到的糖蜜废水来自蔗糖生产工厂。糖蜜废水含有很高的糖分（糖蜜废水含有54%的总糖），主要由62%的蔗糖和38%的果糖组成。
糖蜜废水首先要经过稀释以降低粘度使其易被泵抽取。用0.5mol/l的NaOH溶液调整稀释后的蜜糖废水的PH（由5±0.05调至7±0.05），溶液被保存在恒温4度的持续搅拌冷藏容器中。用来进一步稀释糖蜜废水至10g蔗糖/l的矿物营养液被分别加入反应器（表1），这样做是为了防止糖蜜废水提前发酵。无机营养液包含N源和P源（NH4CL和KH2PO4 /Na2 HPO4)。溶液使用饮用水来制备，用0.5mol/l的NaOH溶液调整PH由5±0.05至7±0.05。调整无机营养液的氨氮和磷酸盐浓度（173—307mgN/l和59mgP/l）以保持C/N/P（以mol量为基础）为100:6:1（稳态1—3）和100:3:1（稳态4）。
2.2.1连续流酸酵解反应器
对工作体积为1140ml的CSTR进行接种，种泥来自处理工业—生活混合污水并且适应了糖蜜废水投料的全尺寸厌氧反应器。在最初的适应期，接种污泥中投加稀释的蜜糖废水（10g蔗糖/l）和营养液（21Nmmol/l和2Pmmol/l），并且反应器非连续运行直至观察到发酵现象出现。之后，反应器调整为连续运行模式，并且要监测生物浓度和发酵终产物，直至获得稳定的发酵状态。使用两台蠕动泵给反应器继续进料，一台投加糖蜜废水另外一台投加营养液。控制稀释的糖蜜废水（410g/l）和无机营养液的流速以使SRT保持在10h，并且初始基质浓度保持在10g蔗糖/l（344Cmmol/l）。
反应器在三种不同的PH值之下运行。利用PH控制器调节反应器的PH，该反应器启闭0.5M NaOH溶液对反应器的供给。搅拌速度维持在400rpm温度控制在30度。试验过程中要对氧化还原电位进行监测。
流出物溢流出反应器，被收集在连续搅拌的冷藏池中（保持在4度）。使用由超滤中空纤维膜组件（可以分离5×105分子量）和蠕动泵组成的过滤装置澄清流出物。在用于批次累积PHA试验或者作为SBR筛选菌群的投料之前，澄清的流出物要维持恒温4度。每天要从反应器、稀释的糖蜜废水供料、无机营养溶液中取样以监测糖分、有机酸（和其他的可能的发酵终产物例如，甲烷）、氨氮、磷酸盐和VSS。使用气体流量计测量气体产量。
2.2.2 富PHA菌群筛选反应器
在ADF条件下运行SBR反应器（工作容积为1000ml），利用发酵糖蜜废水进行PHA富集菌的筛选。反应器接种利用醋酸盐驯化的富PHA混合菌群（Serafim等，2004）。SBR12h的运行周期包括4个独立的阶段：进料（12.5min）、好氧反应（充盈和饥饿交替）（11h）、沉淀（38.5min）和排水（9min）。水力停留时间控制在1d。每天排出100ml的混合液以保持污泥停留时间为10d。向反应器中投加连续流发酵反应器的澄清出流物，发酵反应器按稳态4运行（PH为6以及C/N为100:3，查表1获得成分组成）。在每一个周期的开始阶段用蠕动泵将500ml的滤后发酵蜜糖废水泵入反应器。另外一个蠕动泵在沉淀阶段完成之后抽出反应器的排水（每周期500ml）。在滤后发酵糖蜜废水投料中加入铵盐和磷酸盐使初始反应器溶液中分别含有2.5Nmmol/l和0.32Pmmol/l的浓度。投料中也要加入硫脲来抑制硝化作用。投料中PH控制在8±0.05.用空气泵通过陶瓷曝气头供给空气。转速控制在500rpm。对PH和溶解氧进行监测。泵的运行（进料和排水），曝气，搅拌由本课题组开发的软件程序来自动控制。除此之外，软件也用来PH和溶解氧数据。在既定周期之内，定期从反应器内取样来确定VFA和氨氮摄取、TOC去除效果、PHA储存以及微生物的生长。反应器放置在温控室中（23—25度）。
Serafim等在2004年报道了以醋酸盐为底物筛选PHA富集菌的研究。反应器的运行条件一般被用来描述由发酵糖蜜废水筛选的菌群，而不是以醋酸盐为碳源筛选而来的菌群。
2.2.3 PHA批次富集试验
使用澄清发酵糖蜜废水在不同的CSTR稳态条件下（查看表2）和在ADF条件下利用醋酸盐作为碳源和发酵糖蜜废水筛选的不同的PH富集菌进行PHA富集试验。
PHA富集试验在具有600ml工作容积的容器中进行。在以发酵糖蜜废水为底物或者以醋酸盐为底物进行细菌筛选的SBR的周期末端取出200ml污泥，取出之后加入到400mlPH已经预先调整为7的发酵废水中。
使用空气泵通过陶瓷扩散器进行曝气，利用磁力搅拌器进行搅拌。在批次试验中延时监测有机酸的利用、氨氮的消耗、PHA的储存、微生物的生长状况以及氧气利用率。为了确定OUR,混合液在呼吸计中循环通过（使用蠕动泵），利用电磁搅拌器进行搅拌，在混合液中插入氧电极。循环在既定时间停止，呼吸计中氧浓度的减少被记录下以确定OUR值。富集试验在温控室中进行。
2.3 分析程序
生物浓度的确定使用标准方法中描述的测定VSS的步骤。
使用高效液相色谱法测定乳酸盐、醋酸盐、丙酸盐、丁酸盐和戊酸盐的浓度，使用Merck-Hitachi液谱，装有UV检测器和HPX-87H前置柱和来自BIORAD的柱体。采用0.05M的硫酸作为洗脱液以0.6ml/min的流速和50度的工作温度进行洗脱。检测波长设置在210nm。有机酸的浓度用规程为25—500mg/l的标准曲线进行计算。
糖（蔗糖、果糖、葡萄糖）和乙醇的浓度同样利用HPLC法来测定，使用同样的Merck- Hitachi液谱和Merck-Hitachi视差折光检测器。使用到的柱体和洗脱条件与之前的有机酸测量一致，除了洗脱液的流速不同，后者的流速为0.5ml/min。使用规程为25—500mg/l的标曲来计算糖和乙醇浓度。
总糖的确定使用莫里斯方法以及由Koehler（1952）、Baily（1958）和Gaudey（1958）修正的莫里斯方法。样品用蒽酮试剂在100度进行消解，在625nm的波长处测定吸光度。使用蔗糖标准（0—100mg/l）确定总糖含量。
利用Serafim等（2004）和Lemos等（2006）描述的方法使用气相色谱法来确定PHAs含量。HB和HV的浓度利用P（70%/30%）标准来进行计算并使用正十七烷内标法进行修正。
使用氨气体敏感组合电极测定氨浓度。以规程为NH4Cl的浓度范围（0.01—10Nmmol/l）获得标曲。
使用Shimadzu TOC自动分析仪来测定澄清样品中的总有机碳。利用标准浓度为20—500mgC/l的钾氢钛酸盐和标准浓度为1—25以及20—500mgC/l的纳氢钛酸盐和碳酸钠盐来做出TC和IC标准曲线。
使用尺寸排阻层析装置进行凝胶色谱分析（GPC），装置包括了一个溶剂分配系统，该系统是由型号为510的泵、进样注射器和型号为2410的示差折光检测器组成。运行温度为30度，使用氯仿作为洗脱剂，以1ml/min的速度洗脱。试验用到了容积为150微升的进样器。
2.4 计算
在质量基础上（%PHA=PHA/VSS*100），污泥PHA含量作为VSS的百分比来计算，VSS包含活性生物量（X）和PHA。
最大基质利用率和PHA储存率是通过调整由VFA和PHA浓度的实验数据所绘图像得到的线性函数确定的，在时间零点处计算一阶微商然后除以该点处的活性污泥浓度。VFA的浓度所有有机酸浓度之和。PHA浓度（Cmmol/l）相当于HB和HV单体浓度之和。
基于消耗基质的PHA产量（YX/S以CmmolX/CmmolVFA计）和活性生物产量（YP/S以CmmolX/CmmolVFA）分别由形成的PHA和活性生物除以总的有机酸消耗量得到。
基质利用的呼吸产率的计算是通过将试验得到的OUR（以mmolO2/h）曲线（消耗VFA期间）进行积分然后基质消耗量（以CmmolVFA计）而得到。O2被表示为假定碳消耗1mol氧气形成1molCO2。
已知研究的质量平衡可以表示如下：
ΔY=YP/S+YX/S+YO2/S
总的产量解释了由物质质量平衡得出的碳的回收（如果所有的碳都回收了其值为1）。
3. 结果与讨论
3.1 酸化反应器:PH和C/N比对VFA合成的影响
试验运行了一个1L的CSTR反应器两年时间，投料为糖蜜废水（初始底物浓度为10g总糖/l）。评估了PH值对有机酸产量和浓度分布的影响。共试验了三个不同的PH值（7、6和5），得到了不同的有机酸产量和不同的浓度分布。产生的有机酸包括挥发性脂肪酸：醋酸、丙酸、丁酸和戊酸，以及乳酸。运行过程没有发现乙醇产生。
糖向有机酸的转化率和比产生率与PH值无明显联系，虽然在偏酸条件下获得了略微高的产量。在PH为7时获得了较低的糖向有机酸的转化率，这种现象也许可以被解释为在此PH值条件下发生了产甲烷反应。这些结果与Fang和Liu在2002年所做的实验一致，他们研究了PH值对在CSTR中混合菌群利用葡萄糖产氢试验的氢气产量的影响，反应器运行的水力停留时间为6h。作者观察到了基于葡萄糖的有机酸产率随PH值有微小的变化（在PH值为7、5、6时，产率分别为0.44、0.46和0.48CmmolVFA/Cmmol葡糖糖）。由于糖蜜废水的有机组分不同于葡萄糖，由糖蜜废水获得的产率值相对高于葡萄糖得到的产率值。事实上，糖类占到了蜜糖废水总有机碳的约70%。部分（48%）非糖类有机碳成分在发酵过程中被消耗掉了。蜜糖废水的转化率与已报道的葡萄糖的转化率不同的另一个可能的原因是后者优化了发酵条件以利于氢气的产生，它的代谢途径可能与基质脱羧作用有关系。
与基于底物的有机酸产量和产率不同，有机酸型体分布受PH值影响明显。在PH值为7和6时，挥发性脂肪酸（乙酸、丙酸、丁酸和戊酸）的浓度随着脂肪酸链长长度的增加而减少。醋酸浓度较高，占了生成有机酸超过50%的含量。在PH为5时，醋酸浓度仍较高，丁酸和戊酸的浓度超过了丙酸。在PH为5和7时有乳酸产生。醋酸和丙酸的浓度在PH由5—7时下降，丁酸和戊酸的浓度显著升高。运行低的PH值有助于长链脂肪酸的生成，这是由于在偏酸环境下，会有更多的还原当量加入到脂肪酸链中。（Zoettemeyer等，1982）
之前已经有关于PH值对VFA浓度分布影响的研究，这些研究是以纯糖和复杂基质为底物的（Zoetemeyer 等，1982；Fang和liu，2002；Khanal等，2004）。所有这些研究中都发现了PH值对有机酸形态分布的一个类似的趋势。
初始C/N/P比设定为100:6:1 Cmol：Nmol：Pmol（稳态1—3）以确保发酵反应在过剩的营养条件下进行。出水中剩余的N为10-12 Nmol/L（以氨的形式存在），P为0.20—0.25Pmol/L（以磷酸盐的形式存在）。为了评估C/N比的影响同时又使出水中含有游离氨（在合成PHA阶段用到），C/N比从稳态2的100:6 Cmol：Nmol调至稳态4的100:3 Cmol：Nmol（PH均控制在6）。酸化反应器的出水中的氨氮浓度降至0.1Nmol/l。C/N比没有显著地改变有机酸的形态分布（表1）。然而，糖—酸转化率和比产率则有轻微的下降。
3.2 利用发酵糖蜜废水和由乙酸盐筛选菌群富集PHA
使用以醋酸盐为底物在充盈—饥饿交替条件下生长的混合菌群运行PHA批次富集试验。在不同酸酵解条件下（PH为7—5）产生的滤后发酵糖蜜废水作为底物使用。此试验的目的是考察有机酸浓度分布对利用醋酸盐筛选菌合成PHA产量（基于底物的产率以及多聚体组成）的影响，选用的菌群之前已经显示了高的PHA富集能力。Serafim 等在2004年介绍了筛选此类菌群的反应器运行条件。
3.2.1 利用糖蜜废水富集PHA
图2显示了利用滤后发酵糖蜜废水作为碳源富集PHA的一个典型批次试验的运行结果。乙酸和丙酸的消耗率要高于其他有机酸类，故这两类酸首先被耗尽。丁酸和戊酸的利用率在乙酸和丙酸耗尽之后上升。氧利用率在乙酸和丙酸耗尽之后开始下降，一个短暂时期过后又开始上升，这种现象揭示了微生物菌群对底物转变的适应。在剩余的有机酸被消耗殆尽之后试验观察到氧气利用率的进一步下降。PHA的合成主要与醋酸和丙酸的消耗有关，与丁酸和戊酸的利用联系较小（后两种有机酸大部分是在前两种有机酸耗尽之后才被利用，此阶段PHA合成虽然增加但是幅度微小）。这种现象预计是由于适应了醋酸盐为底物的菌群倾向于利用醋酸和丙酸而非丁酸和戊酸（Lemos 等，2006）。在底物充盈阶段，活生物质的增长与PHA的储存一同进行。
3.2.2 有机酸型体分布对PHA产量的影响
以滤后发酵糖蜜废水为底物，运行三个PHA分别在7、6、5的PHA批次累积试验。试验用到的有机酸浓度相对于各自的出水浓度均得到了稀释（见表1），这是由于批次反应器的容量为600ml，但用到的发酵废水只有400ml。
以发酵废水为底物，通过三个的批次试验获得了不同的PHA储存产率（YP/S）。在PH值为7时发酵废水合成PHA得到的产率较低,在PHA为5时，得到的产率较高。PH为5的试验所用到的碳氮比（21Cmol/Nmol）相对其他两个试验用到的碳氮比（14Cmol/Nmol）相对偏高，这也解释了该试验获得高PHA储存率和低细胞增长率的原因。此外，这些不同也反应了每个反应器所投加的VFA的组成。对使用相同C/N比的头两组试验来说，多聚体储存产率随着乙酸和丙酸的摩尔分数的增加而增加，说明了这两种酸是PHA合成的主要贡献者。
由滤后发酵糖蜜废水获得的PHA储存产率比同种菌群使用纯净基质（Serafim等在2004年以醋酸盐为底物，Lemos等在2006年以醋酸盐/丙酸盐混合物为底物分别得到的产率为0.58和0.51CmmolHA/CmmolVFA）以及报道的其他一系列发酵废水底物所获得的产率要略微偏低。Dionisi等在2005年以发酵橄榄油废水为底物获得了1gPHA/gVFA的PHA储存产率(以COD表示)。作者把这个出乎意料的高产率归因于碳源而非VFA，试验的碳源或许有助于细胞合成PHA的新陈代谢。Bengtsson等在2007年利用发酵造纸废水作为给料在过营养条件下获得了0.33CmmolHA/CmmolVFA的PHA储存产率。
VFA的优先利用情况在三个以发酵糖蜜废水为底物的批次试验中保持一致。醋酸利用率比丙酸（在PH为7、6、5时分别为0.12、0.05、0.10CmmolHProp/CmmolXh）、丁酸（在PH为7、6、5时分别为0.01、0.04、0.05CmmolHBut/CmmolXh）、戊酸（在PH为7、6、5时分别为0.01、0.02、0.02CmmolHVal/CmmolXh）较高（在PH为7、6、5时分别为0.37、0.19、0.16CmmolHAc/CmmolXh）。丁酸和戊酸的利用率在乙酸和丙酸耗尽之后开始上升。三个试验中在PH为5和6时的最大比PHA产率和基质利用率（表3）是类似的，PH为7时的值较高。后者的结果反映了试验中的一个事实，即在PH为6和5时醋酸盐利用率比观察到的数据要高。
利用发酵糖蜜废水获得的最大比PHA富集率比报道的由同种菌群使用醋酸盐或者醋酸/丙酸混合底物（Serafim等在2004年以及Lemos等在2006年分别等到0.47和0.52Cmmol HA/CmmoXh）以及分别丙酸盐、丁酸盐和戊酸盐作为唯一碳源所获得的值要低（Lemos等在2006年分别得到的0.10、0.07、0.08CmmolHA/CmmolXh）。此外，最大比PHA产率比发酵OME获得的值要低(Dionis等在2005年得到0.52CmmolHA/CmmolXh)，但是比报道的发酵造纸废水的值要高很多（Bengtsson等在2007年获得的0.06CmmolHA/CmmolXh）。
最大储存产率（在PH为5时由发酵糖蜜废水合成）换算成基于糖蜜废水的多聚物产率为0.22gPHA/g糖蜜废水（0.26gPHA/gCOD），换算成体积产率为0.43gPHA/1h。这些值介于在已报道的其他由混合菌群（造纸废水合成PHA得到大约0.11gPHA/gCOD，Bengtsson等，2007）和纯菌（0.11至0.33gPHA/g底物和0.05至0.90gPHA/1h，Kim，2000）以低成本碳源为底物合成PHA所得的数值当中。虽然没有确定出最大PHA富集能力，但是在所有以发酵糖蜜废水为底物的批次试验中获得了约30%（PHA单位细胞干重）的细胞PHA含量。
多聚体组成（HB:HV摩尔量比）随着有机酸浓度分布的变化而变化，3HB单体的摩尔分数直接与投料中醋酸和丁酸的摩尔分数成比例，然而3HV单体的摩尔分数却与丙酸、戊酸和乳酸的摩尔分数成比例（图3）。这种情况与碳源利用和多聚体储存的代谢途径是一致的，这种代谢途径已经在纯菌合成中被报道过，并且通常用来预测富集PHA混合菌群的行为（Le mos等，2006）。随着有机酸摩尔分数从0.79/0.21变为0.51/0.49（Ac+But）/（Prop+Val+Lac），多聚物的组成由69:31变为47:53molHB：molHV。这些试验清楚的证明了可以通过调整酸化酵解的PH值来调控多聚物的组成。预前发酵时混合菌群利用利用富含碳水化合物的碳源合成PHA所需要的环节，此阶段一个简单的运行参数便可以控制特定的PHA合成。
3.2.3 氨氮浓度以及蜜糖废水基质对PHA富集的影响
试验曾确定增加酸化酵解反应器的 C/N比不会明显改变发酵废水中有机酸的浓度分布，因此可以考察剩余氨氮浓度对PHA富集的影响。为此，进行了PHA批次富集试验，利用在稳态2和4（均在PH为6条件下运行，但是C/N比分别为100:6和100:3）下产生的滤后发酵蜜糖废水为底物，试验模拟了相似的有机酸浓度分布（表2列出）但不同的剩余氨氮浓度（8.3和0.1Nmmol/l的NH4+）。结果汇总在表3。基于氨氮利用计算得到的增长率在高氨氮和低氨氮浓度时分别为0.37和0.004CmmolX/CmmolVFA。在后一种情况下PHA储存产率相当高（0.62CmmolHA/CmmolVFA对0.45CmmolHA/CmmolVFA）。在前一种情况下，大量可用于细胞生长的氨氮限制了可转化为PHA储存的碳源的分数。此外，比PHA合成率在低氨氮浓度条件下同样较高。这些结果与Serafim等在2004年获得的实验结果一致。
试验获得的PHA储存率比已经报道的由同样的醋酸盐筛选菌（0.79CmmolHA/CmmolVFA）利用醋酸盐和低氨氮（90Cmmol/l醋酸盐和0.7Nmmol/lNH4+）基质所得结果要低，但是与发酵造纸废水在营养限条件下获得的值（0.55—0.67Cmmol HA/Cmmol VFA）近似。
为了确定数值较低的原因是与VFA成分有关还是与糖蜜废水有关，使用具有与上述底物的有机酸分布和氨氮浓度（表2中列出）类似的的合成有机酸混合液为底物，运行了一组批次试验。结果在表3列出。使用模拟投料的PHA储存率（0.62CmmolHA/CmmolVFA）与真实的发酵废水获得的数值结果一致，但是最大比VFA利用率（-qs）和PHA产量（qp）较后者较高。
两个试验的主要不同之处在于VFA利用的先后。在以发酵糖蜜废水为底物运行的试验当中，观察到醋酸和丙酸被优先利用（图2中所示），但在以合成投料为底物的试验中，所有的有机酸酸被同时利用，并且在几乎所有有机酸都被耗尽时获得了最大的的PHA含量。在发酵糖蜜废水中观察到的VFA利用的优先顺序（在合成有机酸底物中没有被发现）似乎与较低的底物利用率和较低的PHA产率联系了起来。糖蜜废水底物当中的非有机以及有机化合物或许是底物消耗情况不同的原因所在。
虽然糖蜜废水底物对PHA储存的影响还没有完全清楚，但目前研究中的发现证明：当用由合成基质获得的预测结果来推断使用复杂基质例如发酵污水的实验结果时需要加以注意。
3.3 使用滤后发酵糖蜜废水进行菌种筛选和PHA合成
在本试验当中，使用酸化反应器在稳态4（PH为6，C/N比为100:3）下获得的发酵废水进行菌种的筛选以及PHA的富集。这些研究旨在考查使用发酵糖蜜废水作为底物来筛选菌种以及合成PHA的工艺的性能。实验的结果将于使用醋酸盐筛选菌群的结果进行比较。
3.3.1 菌种筛选
启动SBR以滤后发酵糖蜜废水为底物在ADF条件下进行PHA富集菌的筛选。将以醋酸盐为底物在充盈饥饿交替条件下生长的PHA富集菌接种于SBR当中（Serafim等，2004）。运转周期为12h，运行条件（见材料和方法）与利用醋酸盐筛选菌群的SBR一致。
为了使工艺尽可能的简单，稳态4（成分见表1）产生的有机酸投加到SBR中，这样有机负荷就为每周期75CmmolVFA。发酵糖蜜废水补充氨氮和磷酸盐（初始反应器浓度分别为1.4N mmol/l和0.32Pmmol/l）在浓度上与补充入最初的醋酸盐筛选菌的氨氮和磷酸盐浓度一致。
图4（a）显示了在反应器接种后一个星期，一个SBR富集周期的有机酸和氨氮利用情况，TOC移除情况以及PHA合成情况。图4（b）显示了每周期反应器的PHA储存率和最大细胞PHA含量。10天之后（一个污泥龄）PHA储存率降至其初始值的一半。从反应器启动开始，细胞PHA含量要比ΔPHA含量高很多（每周期富集的PHA量），这表明每个周期细胞积累的多聚物在相对饥饿的环境下并没有被消耗。这是由于从一个周期到另一个周期VFA利用率在逐渐减少，从而缩短了饥饿期的时间。此外，对从周期中取到的滤后混合液样品进行总有机碳分析，结果表明底物中的有机成分（非VFA）在VFA被消耗尽之后会继续被生物利用，因此缩短了饥饿阶段的长度。最终，充盈/饥饿比将会导致PHA富集菌群的筛选受到影响。在反应器接种20天后，ΔPHA含量随着时间一直下降，最终接近零，表明细胞不再合成PHA。反应器的运行条件导致了筛选到的菌群没有合成PHA的能力。
首次试验失败之后，使用对前者接种的菌群启动了一个新的反应器，有机负荷降至每周期30CmmolVFA（将酸酵解反应器的出水浓度稀释至原来的2/5），这是为了降低充盈持续时间对饥饿持续时间的比值。筛选的菌群又一次失去了PHA储存能力。
假定菌种筛选失败的原因与充盈对饥饿的时间比有关，使用同样的菌种对第三个反应器进行接种，其有机负荷控制在每周期30CmmolVFA，初始氨氮浓度在2.5Nmmol/l，以确保在整个SBR周期内营养充足。在整个周期之内均有氨氮存在是为了让PHA富集菌在饥饿阶段利用内部储存的多聚物以及外在的氨氮继续生长，因此使这些菌种相对于非PHA富集菌（即可以降解发酵糖蜜废水中非VFA成分的菌群）更具竞争优势。
图4（c）显示了在富集SBR中（接种过后20天）有机酸和氨氮的利用情况，TOC的移除以及PHA的合成情况。在底物充盈阶段观察了细胞的生长和PHA的储存以及碳源和氨氮的利用情况。在底物匮乏阶段（有机物被全部耗尽）氨氮和胞内储存的多聚物仍被缓慢利用，以提供细胞生长的碳源、能量和营养物质。在VFA消耗尽之后，剩余的TOC仍然是一常量。
这种方法筛选到了具有稳定PHA富集能力的菌种。在反应运行的50d内，细胞PHA含量最初开始下降，这是接种菌群胞内已存的PHA被消耗所致。ΔPHA含量一直保持恒定，证明富集过程表现平稳。在反应器接种后，经过约一个排泥周期，PHA含量与ΔPHA含量趋于一致，表明在一个周期之内合成的PHA在底物相对匮乏的阶段被微生物消耗。从这个时间点之后，两者的值都保持在约10%（gPHA/g细胞干重）。由于有机负荷较低（每周期30CmmolVFA）同时细胞浓度相对较高，导致这两个值都比较低。
Serafim等在2004年以及Lemos等在2006年时在分别用醋酸盐和丙酸盐筛选细菌时用到了一个不同的方法，即仅在SBR周期的底物充盈阶段存在氨氮。这是由于利用单一的基质会带来明确的充盈阶段与匮乏阶段的比值，因此可以使具有PHA合成能力的的菌群在系统中占主导地位。实际上，试验结果表明当使用合成基质而非真正的复杂底物（例如发酵废水）时，用于筛选PHA富集细菌的反应器运行条件是不一致的。
3.3.2 合成PHA
污泥在反应器接种运行50d之后筛选完毕，使用一个批次反应器来评估筛选污泥的PHA合成能力，以在稳态4条件下产生的滤后发酵糖蜜废水为底物。与使用醋酸盐富集菌群过程所观察到的情况不同，底物中的有机酸被同时消耗，这可能由于筛选菌群更适应与混合基质而不是单一基质。共聚物（HB-Co-HV）产生。使用凝胶色谱确认共聚物的成分（在色谱图上获得了单峰）。
滤后发酵糖蜜废水中的有机酸分布以及剩余氨氮与在限制氨氮条件下投加给醋酸盐筛选菌的底物的成分一致。PHA储存率和PHA产率都比利用醋酸盐筛选菌所获得的要低（0.44对0.62CmmolHA/CmmolVFA以及0.12对0.23CmmolHA/CmmolXh）。值得注意的是发酵糖蜜废水筛选的细菌呼吸效率（YO2/S）要比醋酸盐筛选细菌的高。此外，从醋酸盐筛选细菌观察到的结果不同，在反应器投料之后，细菌没有直接开始消耗醋酸（醋酸的利用曲线很缓慢）。事实上，富集试验中两者初始醋酸浓度是接近的（70和68Cmmol/l），但它们各自的初始比醋酸利用率却明显不同（0.19和0.04CmmolVFA/CmmolXh）。这些因素综合起来也许可以证明在发酵糖蜜废水富集菌群时醋酸盐会产生抑制作用。
为了证明这种假设，使用初始浓度较低（61CmmolVFA/l）的发酵糖蜜废水（相当于醋酸盐浓度从68Cmmol/l降至37Cmmol/l）为底物，运行第二个批次富集试验。虽然仍观察到了醋酸利用的一个短暂停滞期（图5），PHA储存率上升到0.59CmmolHA/CmmolVFA，这个数值与醋酸盐筛选菌获得的值（0.62CmmolHA/CmmolVFA）接近，但是最大比基质利用率和聚合物产率（分别为0.21CmmolHA/CmmolXh和0.14CmmolHA/CmmolXh）比后者较低（0.26 Cmmol HA/CmmolXh和0.23CmmolHA/CmmolXh）。Serafim等已经在2004年提出了醋酸盐的抑制作用，但这种情况仅发生在醋酸盐浓度高于90Cmmol/l。试验的结果可能证明了利用发酵糖蜜废水筛选的细菌比原来的醋酸盐筛选菌对醋酸的抑制作用更为敏感。然而，在富集阶段，可以通过分批供给少量的基质来克服这一抑制作用。
4. 结论
本试验成功地建立了混合菌群利用糖蜜废水合成PHA的三阶段工艺。
试验中获得的主要结论归结如下：
（1） 发酵反应器的PH值影响了产生的挥发性有机酸的成分，进而直接影响了合成的PHA的组成成分（试验获得的成分变化：从69:31到47:53molHB：molHV）。这个结果表明可以通过简单地控制酸酵解反应器的PH值来操控聚合物的组成。
（2） 在富集阶段高氨氮浓度显示了对PHA合成的不利影响，但同时也刺激了筛选阶段PHA富集菌群的形成。
（3） 使用低的有机负荷和高的氨氮浓度，以发酵糖蜜废水为投料获得了稳定的PHA富集菌群，为PHA富集准备了筛选获得的菌群。
（4） 以发酵糖蜜废水获得的菌群相比较醋酸盐筛选菌群，其PHA富集能力较低（低PHA储存率、低产生率以及对醋酸盐抑制效应的高敏感度）。但是，考虑到总的工艺成本，纯净底物的成本会变得突出，相比较于发酵糖蜜废水的低产率和产量。
（5） 虽然高度集成的三阶段合成PHA工艺仍处于起步阶段，但是该研究阐明了这种侧流工艺的优越性，为使用不同的条件或方法来优化菌种筛选和PHA富集提供了可能性。