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本科毕业论文---绿僵菌抗药性菌株的驯化选育.doc
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1、学号:毕 业 论 文 (设 计)( 2011 届本科)题 目: 绿僵菌抗药性菌株的驯化选育 学 院: 科学技术学院 专 业: 植物保护 姓 名: 指导教师: 副教授 完成日期: 2011 年 6 月 20 日毕业论文任务书论文(设计)题目绿僵菌抗药性菌株的驯化选育下发任务日期20109学生姓名指导教师 副教授一. 论文(设计)主要内容(1) 制作培养基,菌落扩繁(2) 绿僵菌对嘧霉胺抗药性菌株的诱导(3) 绿僵菌菌株抗药性水平的确定(4) 绿僵菌 的抗性菌株与敏感菌株产孢量的比较(5) 绿僵菌的抗性菌株与敏感菌株丝生长速率的比较(6) 绿僵菌抗性菌株的遗传稳定性二.论文(设计)的基本要求(1)
2、掌握文献资料检索技术。(2)掌握试验方案设计方法并进行可行性论证。(3)学习真菌的纯化接种的方法。(4)掌握掌握产孢量和生长速率的测定方法。(5)掌握绿僵菌抗性菌株的遗传稳定性测定方法。(6)学会对数据采集、整理和分析的技能。(7)独立撰写出符合要求的论文。三.论文(设计)工作进度安排阶段论文(设计)各阶段名称日期1查阅资料2010.102010.112分离真菌,纯化,扩繁2010.112010.13菌株的鉴定,抗药性水平的确定2011.12011.24绿僵菌的抗性菌株与敏感菌株产孢量和生长速率的比较2011.22011.35绿僵菌抗性菌株的遗传稳定性2011.32011.46整理数据撰写论文
3、2011.42011.6备注:四.应收集的资料及主要参考文献(指导教师指定)1. 植病研究法,方中达编著,北京:中国农业出版社,19982. 植物化学保护研究方法,慕立义编著,中国农业出版社,19913有关绿僵菌和嘧霉胺的相关文献资料.4有关绿僵菌研究进展和方面的文献资料说明:此任务由指导教师填写一式两份,一份发给学生,一份发给指导教师留存。沈阳农业大学毕业论文(设计)选题审批表选题名称绿僵菌抗药性菌株的驯化选育题目来源导师指定学号姓名专业植物保护指导教师职称副教授研 究内 容(1) 制作培养基,菌落扩繁(2) 抗药性菌株的诱导(3) 抗药性水平的确定(4) 抗性菌株与敏感菌株产孢量的比较(5
4、) 抗性菌株与敏感菌株丝生长速率的比较(6) 抗性菌株的遗传稳定性确定研 究计 划培养基制作,菌落扩繁 2010年11月1日2010年11月20日抗药性菌株的诱导 2010年11月20日2011年1月20日抗药性水平的确定 2011年1月20日2011年2月10日抗性菌株与敏感菌株 2011年2月11日2011年3月11日孢量和菌丝生长的比较抗性菌株的遗传稳定性确定 2011年3月12日2010年4月11日撰写论文 2010年4月12日2010年6月5日特 色试验通过室内化学药剂诱导,初步获得了对嘧霉胺的抗性菌株,研究了抗药性菌株的生物学性状,评估其抗药性,为嘧霉胺的合理推广应用提供依据。指
5、导 教 师 意 见教 研 室 意 见学 院 意 见毕业论文指导记录学生姓名专业植物保护指导教师姓名职称副教授本年度指导毕业生人数11人论文(设计)题目绿僵菌抗药性菌株的驯化选育指 导 过 程时间地点指导内容20101162010112020101125201011262010121020111.2020112220112520112820113202011418农业大学248实验室农业大学246实验室农业大学246实验室农业大学246实验室农业大学248实验室农业大学248实验室农业大学246实验室农业大学250实验室农业大学248实验室农药学教研室农药学教研室查阅相关绿僵菌文献如何制作PDA
6、培养基如何使用无菌操作台识别菌落形态接种,扩繁分离出来的菌株鉴定分离出来的菌株测量生长速率测量产孢量绿僵菌菌株抗药性水平的确定绿僵菌抗性菌株的遗传稳定性总结试验,数据整理学生签字:年 月 日 指导教师签字:年 月 日教研室主任签字:年 月 日沈阳农业大学毕业论文考核表论文题目:绿僵菌抗药性菌株的驯化选育姓名: 学号: 专业: 植物保护 指导教师评语: 指导教师(签字): 年 月 日评阅人评审意见: 评阅人(签字): 年 月 日成绩:答辩委员会意见: 主任委员(签字): 年 月 日注:答辩委员会意见除填写简要评语、给出成绩外,还要提出是否授予学位的建议目 录摘 要1ABSTRACT2前 言31材
7、料与方法51.1材料51.1.1供试病原菌51.1.2供试药剂51.1.3供试培养基51.1.4仪器及用品51.2试验方法51.2.1绿僵菌对嘧霉胺抗药性菌株的诱导51.2.2 绿僵菌菌株抗药性水平的确定51.2.3绿僵菌的抗性菌株与敏感菌株产孢量的比较61.2.4 绿僵菌的抗性菌株与敏感菌株丝生长速率的比较61.2.5 绿僵菌抗性菌株的遗传稳定性62 结果与分析62.1绿僵菌对嘧霉胺抗药性菌株的诱导62.2绿僵菌菌株抗药性水平的确定72.3绿僵菌的抗性菌株与敏感菌株产孢量的比较72.4 绿僵菌的抗性菌株与敏感菌株的菌丝生长速率的比较82.5 绿僵菌抗性菌株的遗传稳定性93结论与讨论103.1
8、 结论103.2 讨论10参考文献13致谢15沈阳农业大学学士学位论文摘 要绿僵菌(Metarhizium anisopliae)半知菌类、丛梗菌目、丛梗霉科、绿僵菌属,具有广谱性。绿僵菌对寄主的入侵是寄主与病原菌之间的生理生化作用的综合结果,可通过体壁、气门、消化道等多种途径侵染宿主,其中体壁途径是主要方式。本文研究嘧霉胺驯化诱导绿僵菌产生抗性菌株,研究绿僵菌对嘧霉胺的抗性风险。绿僵菌在含嘧霉胺的培养基上经逐代驯化,获得了抗嘧霉胺的菌株R1、R2、R3、R4,经抗药性水平测定, R1、R2、R3、R4的抗性倍数分别为10ug/ml,100ug/ml,500ug/ml,1000ug/ml四株抗
9、药性菌株均为对嘧霉胺的抗性菌株。本文比较了抗药性菌株和敏感性菌株的生物学性状。采用菌丝生长速率法测定了抗性菌株与敏感菌株的菌丝生长速率,结果表明经7d培养抗性菌株菌落直径在0.5-1.1cm之间,而敏感菌株为1.3cm,生长速率存在明显差异;在及抗性菌株与敏感菌株的产孢量大约都在3.6107个/ml,说明室内诱导的高抗突变体不能正常生长,菌株对药剂的抗药性水平与菌株产孢能力没有相关性,而是由菌株本身决定的。本试验初步研究了抗性菌株的遗传稳定性,抗性菌株的第零代到第六代的的结果表明绿僵菌的抗药性菌株与敏感菌株的不同转代的有差异性,从第零代第三代到第九代逐渐减小,第零代与第三代和第六代下降明显,第
10、三代与第六代下降幅度很小,但始终保持着对嘧霉胺的高等抗性,表明抗性菌株具有良好的遗传稳定性。关键词:绿僵菌;嘧霉胺;抗性菌株;生物学特性;遗传稳定性Abstract Metarhizium anisopliae of imperfect fungi, bacteria present stem bundle, bundle pullulans Branch, Metarhizium genus, with a broad spectrum. Metarhizium anisopliae on the host and pathogen invasion of host physiologica
11、l and biochemical roles between the combined result of , through the body wall, valves, and other ways to infect the host alimentary tract, which way is the main way the body wall. Domestication of this study pyrimethanil resistance induced by Metarhizium anisopliae strains of Metarhizium pyrimethan
12、il resistance risk. Metarhizium Pyrimethanil containing medium domesticated by each generation, access to the strains of anti Pyrimethanil R1, R2, R3, R4, measured by the resistance level, R1, R2, R3, R4 of the resistance ratio Respectively, 10ug/ml, 100ug/ml, 500ug/ml, 1000ug/ml four resistant stra
13、ins were resistant to the strains of pyrimethanil.This paper compares the sensitivity of drug-resistant strains and strains of biological traits. Mycelial growth rate method with the resistant strains and sensitive strains of mycelium growth rate, the results show that the resistant strains by the 7
14、d culture colony between 0.5-1.1 cm in diameter, and sensitive strains of 0.9 cm, growth Rate significantly different; in and resistant strains and sensitive strains in sporulation of about 3.6 107个 / ml, shows high resistance to indoor induced mutants can not grow normally, the level of strains and
15、 strains resistant pharmaceutical sporulation Ability of no correlation, but the decision by the strain itself. Preliminary study of the test the genetic stability of resistant strains, resistant strains of the zero generation to the sixth generation of the results showed that the resistant strains
16、of Metarhizium anisopliae and sensitive strains have different transfer on behalf of the differences, from zero To the ninth generation of the third generation decreases, the zero and third-generation and sixth generation decreased significantly, the third decrease in generation and sixth generation
17、 of small, but always maintained the high resistance to pyrimethanil, indicating that the anti-Strains with a good genetic stability.Key words: Metarhizium anisopliae; pyrimethanil; resistant strain; biological characteristics; genetic stability前 言绿僵菌是世界上最早大量生产并用于田间防治的昆虫病原真菌之一。能够寄生于多种害虫的一类真菌,通过体表或取食
18、作用进入害虫体内,在害虫体内不断增繁殖通过消耗营养、机械穿透、产生毒素,并不断在害虫种群中传播,使害虫致死。绿僵菌具有一定的专一性,对人畜无害,同时还具有不污染环境、无残留、害虫不会产生抗药性等优点。是自然界中一类有效而且极其重要的自然控制因子,不需要人类的干预就能造成许多害虫周期性的大量死亡。流行病发生以后,可以控制害虫的种群数量,减少化学农药的用量,维护生态平衡,降低防治成本,减少环境污染,有利于可持续发展。就病原来说,昆虫对真菌易被感染,因为真菌是通过孢子产生芽管而直接穿透体壁进行感染的,而其它微生物如病毒、细菌和原生动物主要是经口传染。绿僵菌对寄主的入侵是寄主与病原菌之间的生理生化作用
19、的综合结果,可通过体壁、气门、消化道等多种途径侵染宿主,其中体壁途径是主要方式。绿僵菌制剂属于活体类微生物,其防效在很大程度上受到外界环境条件的制约,尤其是温度、湿度和紫外线的影响,为了解决这一难题,必须依赖剂型的开发和改进,添加促进孢子在低温、低湿条件下萌发的助剂和紫外保护剂。中国研究开发绿僵菌起步晚,经过多年的研究开发在菌株选育、生产工艺、剂型和防治对象上已有长足进步。目前,重庆大学基因研究中心完成了杀蝗绿僵菌生物农药的研制,取得了重要的研究成果,生产的产品已在国内多个省份示范试验。 与传统的化学药物不同,绿僵菌复合剂用虫生真菌消灭白蚁、蝗虫等害虫。田间大规模应用试验的结果显示,绿僵菌能适
20、用于室内外,在防治桉树白蚁方面具有用量少、成本低,保证苗木成活率95以上的特点。据悉,目前绿僵菌灭白蚁、蝗虫的方法已经作为国家重点推广应用项目,可广泛应用于农田、林木、桥梁等多个领域的防治工作。每株桉树增加2分钱的成本,就能使95以上的桉树逃脱白蚁的摧残。 利用绿僵菌防治害虫的方法很多,如它可支撑粉剂或液剂进行大面积田间撒布,也可拌种或混入肥料内,或制成颗粒剂施用防治害虫。在绿僵菌剂中加入少量化学农药,有增效作用。可以防治松毛虫,玉米螟,稻叶蝉和稻飞虱,大豆食心虫等。嘧霉胺(pyrimet hanil) 是近几年出现的新一代嘧啶胺类杀菌剂,20 世纪90 年代初,嘧霉胺率先在欧洲大面积推广,1
21、998年嘧霉胺在我国首次获得农药登记。具有保护、叶片穿透及根部内吸活性,对葡萄、草莓、番茄、洋葱、豌豆、黄瓜、茄子、果树的病害有优划的预防、治疗特别是铲除效果。嘧霉胺作用位点单一,属高抗药性风险杀菌剂,它的作用机理独特,即抑制病原菌蛋白质分泌,降低某些水解酶水平,而这些水解酶与病原菌引起寄生组织坏死有关。嘧霉胺同现在应用的三唑类、二硫代甲酸酯类,苯并味唑类及乙霉威类杀菌剂,无交互抗性,因而对抗性病原菌或敏感病菌均有效。嘧霉胺使用较多的沈阳市、辽阳市、大连市和鞍山市抗药性频率较高。在离体条件下,抗药性菌株具有良好的遗传稳定性及与敏感菌株相似的适应性,这意味着抗药性菌株在田间具有较高的适合度 ,如
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