碱基顺序的化学分析法省公共课一等奖全国赛课获奖课件.pptx

3.5核酸碱基次序分析中化学方法核酸碱基次序分析中化学方法 DNA化学次序方法于1977年由A.M.Mamamx和W.Gilbert第一次报道，所以又称为MG法（化学降解法）。这一方法是将模板DNA一端标识，之后按碱基次序逐一地将整个大分子断裂，标识DNA片段长度或大小与每个碱基所在位置相对应，当这些反应产物经过变性聚苯稀酰胺凝胶电泳分离后，其代表DNA次序便能够从同位素标识自显影带形上读出。这项技术能够测出距离标识位点250核苷酸以内DNA序列。经过多年努力在模板DNA末端标识和特异性化学反应方面都进行了改进，使这一方法成为DNA序列分析基本方法。第1页化学降解法测序原理 在MG法测序系统中，一个末端标识DNA片段在4组或5组互为独立化学反应中分别得到部分降解，其中每一组反应特异地针对某一个或某一类碱基。在这几组反应中经过化学裂解形成放射性标识分子含有共同起点放射性标识末端，而其终点不一样发生化学降解位点。每组混合物中含有长短不一DNA分子，其长度取决于该组反应所针正确碱基在待测DNA全长片段中位置。今后，将各组反应产物进行序列胶高压电压分离，再经过放射自显影显示序列结果。第2页原理示意图第3页方法成败关键一、对特定碱基进行化学修饰二、经过修饰碱基从糖环上脱落，DNA主链在修饰碱基5 和3 磷酸二脂键断裂。第4页DNA样品制备待测DNA样品末端标识单末端标识DNA片段分离纯化碱基特异化学裂解反应序列胶高压电泳分解读取序列化化学学法法测测序序普普通通流流程程第5页载体选择化学法中用最多是Messing及其同事构建pUC系列载体。它们是化学法测序中比很好载体。第6页Puc质粒系列图谱第7页Psp64/图谱第8页DNA样品制备 DNA样品必须是来自转化细胞单菌落，绝对不含有宿主细胞染色体DNA及其RNA。1、氯化铯-溴化乙啶梯度平衡离心法纯化质粒DNA。2、寡核苷酸从固相支持物上洗脱下寡核苷酸不含有5末端磷酸基团。测序前用高压液相柱或电泳技术纯化进行5末端标识。第9页DNA样品末端标识Klenow片段酶介导标识反应1.在一支微量离心管中加入：含有3 凹端DNA片段 3种dNTP混合液 Klenow片段酶缓冲液 -32P-dATP2.混合均匀后加入0.5微升Klenow片段酶，混匀后置于20-22 保温30分钟。3.70 加热10分钟终止反应。第10页单末端标识DNA片段分离和纯化 普通采取变性DNA中性琼脂糖凝胶和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法进行分离。最惯用洗脱方法是机械洗脱和电洗脱，当前已经有许各种商品化电洗脱装置，性能优良回收率高。第11页双链双链DNA解链及两条链分离回收解链及两条链分离回收双链双链DNA变性变性 1.在一支微量离心管中加入 32P标识DNA片段;变性加样溶液 2.混匀后置于90 保温2分钟，快速放入冰浴冷却。非变性聚丙烯非变性聚丙烯 酰胺凝胶电泳分离酰胺凝胶电泳分离 制备一块适宜浓度非变性聚丙烯酰胺凝胶确定凝胶中放射性标识确定凝胶中放射性标识DNA片段位置片段位置 1.电泳结束后，轻轻去掉一块玻璃板，用保鲜膜盖住胶，再将放射性溶液取几滴于3 滤纸条上，置于胶不对称四点上，用透明胶带固定。将整个凝胶投入X射线胶片暗合内，上面覆盖一张X射线胶片进行放射自显影。室温曝光5-10分钟后显影、定影。不一样大小片段便展现出来。2.将凝胶上四处人为标识与X射线胶片上对应显影点重合，则对应于X射线胶片上DNA单链显影处凝胶必定含有这个单链标识DNA片段。用注射器针头沿显影条带四面穿孔并直入凝胶内，再将已被针孔划出范围凝胶用锐利刀片切割下来，放入一支离心管中。第12页从聚丙烯酰胺凝胶中洗脱回收从聚丙烯酰胺凝胶中洗脱回收DNA方法一 机械性洗脱【碾碎-浸泡-过滤-沉淀法】1、将切下胶块置于1.5 ml微量离心管中2、用洁净玻璃棒将胶块捣碎3、加入400 l洗脱缓冲液4、盖好管盖并用parafilm膜封口5、37 震荡最少4小时或过夜6、用硅化玻璃棉装入一个1ml枪头7、将洗脱液过滤到一支微量离心管中8、再另加100 l洗脱缓冲液到洗脱管中洗脱残余样品9、重复710、用手提式射线监测器监测过滤样品，样品应大部分得以回收11、像过滤样品中加入1.0ml无水乙醇，-70 放置5分钟沉淀DNA样品12、在4 以15000r/min离心15分钟搜集DNA沉淀并在真空下干燥DNA沉淀13、将沉淀重新溶于200 l0.3mol/l乙酸钠中，加入500 l无水乙醇，-70 放置5分钟14、在4 以15000r/min离心15分钟15、用95乙醇洗沉淀样品一次，然后真空干燥DNA样品第13页方法二 电洗脱1、小心将胶条置入一个直径1cm透析袋中，钳住一端2、加1 TBE于透析袋中，赶出气泡3、挤出多出缓冲液，再扎紧透析袋另一端4、将透析袋置于水平电泳板上用1 TBE浸没5、恒压100V电泳6、改变电泳方向，30秒，使样品脱离透析膜7、取出透析袋，用新枪头吸收透析袋中缓冲液到另一新离心管中8、用1/2体积1 TBE洗净透析管，并将其吸入样品管中9、用酚抽提洗脱回收样品，然后以乙醇沉淀第14页经过第二次限制酶酶切及凝胶电泳分离回收末端标经过第二次限制酶酶切及凝胶电泳分离回收末端标识识DNA片段片段第二次限制性酶酶解将干燥DNA样品溶于适量体积双蒸水中，溶解完成，加入：10 限制酶缓冲液 适当限制性内切酶补充灭菌双蒸水至总体积为20 l，混匀后于37 保温2小时若酶切反应完全，像酶切反应液中加入5ul加样缓冲液非变性聚丙烯凝胶电泳分离第15页合成寡核苷酸合成寡核苷酸DNA样品样品5 末端标识末端标识合成寡核苷酸DNA测序前应用T4多核苷酸激酶进行5 末端标识。1、取100ng oligo样品溶于20 l双蒸水中，加入：10 T4多核苷酸激酶 T4多核苷酸激酶 -32P-ATP2、混匀后置于37 保温30分钟3、加入10ul加样缓冲液以终止反应4、上样于20非变性聚丙烯酰胺凝胶，以300V电泳适当初间5、放射自显影和洗脱第16页特异性碱基化学裂解反应碱基特异性地裂解反应包含：先对特定碱基进行化学修饰；碱基消除：是修饰碱基从糖环上脱落。要确保每一个DNA分子平均只有一个靶碱基被修饰。随即用哌啶裂解修饰碱基5 和3 位置。得到一组长度从一到数百个核苷酸不等末端标识分子，比较G,A+G,C+T,C各个泳道，可从测序凝胶放射自显影片上读出DNA序列第17页测序流程图第18页第19页合成寡聚核苷酸MG测序法合成 100碱基以下寡聚核苷酸测序方法唯一不一样之处于于碱基修饰反应时间。G反应20分钟G+A反应为1小时T+G反应为1小时C反应应为1小时切割产物可用20变性PAGE胶进行分离第20页序列胶高压电泳及序列阅读核苷酸次序阅读 化学裂解反应并不完全是绝对碱基特异性，四条带为G，G+A，C+T，C。这些带分别来自G，G+A，C+T，C处断裂DNA片段中心两条带G+A，C+A，含有全部标识DNA降解产物。需要经过从C+T泳道出现条带中扣除C泳道条带而推断T残基位置，一样，A残基位置也要经过从A+G泳道条带推断出来。读片时应从底部开始，越靠近标识端断裂那些产物越靠近胶片底部。第21页MG法与Sanger双脱氧链终止法比较与进行合成反应双脱氧链终止法不一样，MG法是对待侧DNA进行化学降解。应该说，这一方法是在体外研究Iac阻抑物与Iac操纵基因相互作用时酝酿发展起来。所以，MG法所独具鲜明特点是能够探测DNA构象和蛋白质-DNA相互作用。然而，因为种种原因（如采取32P进行放射性标识、末端标识DNA比活度、裂解位点统计学分布、凝胶技术方面不足等），MG法所能测定长度要比Sanger法短一些，它对放射性标识末端250个核苷酸以内DNA序列效果最正确。伴随M13噬菌体和噬菌粒载体发展，加上酶学方法改进以及双链DNA测序技术发展，双脱氧链终止法如今比 MG法应用广泛。然而，化学降解法较链终止法含有一个显著优点：所测序列来原DNA分子而不是酶促合成反应所产生拷贝。所以，MG法有着Sanger法所不含有特殊用途：能够对合成寡核苷酸进行测序；能够分析诸如甲基化等DNA修饰情况：能够经过化学保护及修饰干扰试验来研究DNA二级结构及蛋白质与DNA相互作用等。然而，因为Sanger法既简便有快速，所以是当前最正确选择方案。实际上，当前大多数测序策略都是为Sanger法而设计。第22页双脱氧链终止法双脱氧链终止法M13单链测序系统单链测序系统双脱氧链终止法测序是Sanger等于1977年建立起来。该法测序原理简单，操作轻易，均能我饿诶普通试验室所接收，当前成为世界各试验室测序主要方法。在Sanger链终止测序基础上，逐步形成了越来越完善序列测定系统。早期，经过分子克隆技术将目标DNA插入到单链线状噬菌体M13载体上，提取单链模板用于序列测定。而伴随技术改进和发展，当前双链DNA测序水平已基本靠近M13系统。所以，能够相信质粒系统将越来越被广泛应用。近几年，因为高温DNA聚合酶广泛应用于双脱氧链终止法测序，故建立了更为简单、方便测序方法，能够直接对体外扩增DNA产物进行序列测定，无须将其克隆在载体上。第23页双脱氧链终止法测序原理酶学原理：在正常体外合成反应体系中，加入核苷酸单体为4种2-脱氧核糖核苷酸三磷酸、这一反应 体系中，引物与模板退火形成双链区后，DNA聚合酶便结合到DNA双链区上而开启DNA合成：在引物引导下，聚合酶在模板链上沿3-5方向移动，利用体系中4种核苷酸聚合成一条与模板链互补DNA新生链。第24页机构图第25页然而在体外合成反应体系中加入双脱氧核苷三磷酸，DNA合成情况则完全不一样。这些双脱氧核苷三磷酸在DNA聚合酶作用下，经过其5 三磷酸基团与正在延伸DNA链末端脱氧核糖3-OH发生反应，形成磷酸二酯键而掺入到DNA链中，但它们本身没有3-OH，不能同后续dNTP形成磷酸二酯键，所以，正在延伸DNA链终止。假如再加入一个一定百分比ddNTP，则新合成DNA在可能掺入正常DNTP位置都有可能掺入ddNTP而造成新合成链在不一样位置终止。因为竞争，所以，产物是一系列长度不一样多核苷酸片段。这些片段含有共同起点引物5 端，而有不一样终点，其长度取决于ddNTP掺入位置与引物5 端之间距离。第26页原理图第27页载体系统含有特殊生活周期单链丝状噬菌体M13是Sanger双脱氧链终止法测序工作最先选择。在M13生活周期中，现有复制型双链DNA，又有单链DNA形式。前者能够作为克隆载体，后者能够作为序列测定模板。所以，能够将目标DNA与M13RF双链DNA相连而到达克隆目标，然后提取成熟M13噬菌体并纯化单链DNA作为测序模板。M13载体系统用于序列测定载体有它优点。当前惯用M13载体为M13mp18与M13mp19.第28页M13系统单链DNA序列测定M13DNA物理图谱第29页M13/1918图第30页M13载体系统双脱氧测定图从第31页M13载体系统双脱氧链终止法序列测定单链模板DNA制备双脱氧测序反应序列胶高压电泳及放射自显影DNA序列阅读第32页单链模板DNA 制备将待测目标DNA插入到M13载体上MCS中，经过转染受体菌取得重组克隆噬菌体。M13感染细胞后并不使细胞裂解，但感染细胞生长迟缓，并不停释放成熟噬菌体，一个细胞在噬菌体复制每一代释放出200左右噬菌体。在液体培养基培养感染细胞时，噬菌体不停从细胞中释放出来并在培养基内积累。从单一噬菌斑形成噬菌体颗粒或从细菌菌落中小规模制备单链M13噬菌体或噬菌粒DNA，惯用方法有PEG法及乙酸沉淀法。第33页PEG法制备M13试验程序第34页双脱氧测序反应利用Klenow片段酶测序反应 一 引物与模板退火 Klenow片段酶介导链延伸-链终止反应 RT反转录酶介导链延伸-链终止反应 二依据BRL企业提供程序略加改动 准备工作配制核苷酸贮存液 引物与模板退火 链延伸-链终止反应 三 以下依据Boehringer Mannheim企业提供资料编写 准备工作配制d/ddNTP混合液 引物-模板退火 链延伸-终止反应第35页