藏族和汉族牙周炎患者龈下微生物群落结构分析.pdf

北京口腔医学 2023年第31卷第2期 Beijing Journal of Stomatology April 2023，Vol.31，No.2129牙周炎是发生在牙周支持组织的感染性疾病，其始动因子是菌斑微生物及其产物。菌斑微生物包括龈上菌斑和龈下菌斑，其中龈下菌斑不易受唾液和咀嚼等影响。龈下微生物的检测方法很多，随着宏基因组技术的进步，越来越多的学者使用高通量测序技术从整体上分析细菌的组成和结构1,2。16SrRNA 测序技术是最常用的高通量测序依赖组学技术之一，通过生物信息学分析可以获得细菌组成、物种丰度、系统进化、群落比较等诸多信息。学者发现，居住于高原地区的人群慢性牙周炎的患病率和严重程度明显高于平原地区，并随着居住地海拔的升高、居住时间的延长而显著升高，高原移居者牙周炎患病率也高于世居者3，缺氧会加重牙周炎4。本研究使用 16SrRNA 高通量测序的方法分析西藏藏族和汉族牙周炎患者龈下微生物群落结构差异，并初步探讨西藏的汉族牙周炎患者从高原地区返回平原地区后龈下微生物结构的变化，以初步探讨高原和民族因素对牙周炎患者龈下菌群的影响。资料和方法1.研究对象 病例选自西藏自治区人民政府驻成都办事处医院口腔科门诊慢性牙周炎患者共 39 例，均因工作或生活长期居住在西藏 10 年以上，藏族 20 例，汉族19例，男性26例，女性13例，年龄范围2381岁，平均年龄（4611.45）岁。慢性牙周炎的纳入标准：藏族和汉族牙周炎患者龈下微生物群落结构分析杜启莲 唐灿 袁星 李紫嫣【摘要】目的 比较西藏藏族和汉族牙周炎患者龈下微生物群落结构的差异，并初步探讨汉族牙周炎患者从高海拔地区到低海拔地区后龈下微生物群落结构的变化。方法 纳入长期在西藏的藏族牙周炎患者 20 例和汉族牙周炎 19 例，用 Illumina MiSeq 测序平台进行龈下菌斑的 16SrRNA 高通量测序，对比分析二者的微生物群落结构差异。选择 5 例西藏汉族牙周炎患者，对比其从西藏高海拔地区到成都平原地区后龈下微生物群落结构的变化。结果 西藏汉族牙周炎患者的龈下微生物物种丰富度及微生物多样性均比藏族略高，西藏汉族牙周炎患者到达成都 2 个月后，相比刚到达 1 周时，物种丰度和微生物多样性增加，但均无统计学差异。西藏汉族牙周炎的产线菌属较藏族高，西藏汉族牙周炎患者到达成都平原后弯曲杆菌、艾肯氏菌显著增加。结论 民族与海拔因素可能对牙周炎患者的龈下微生物群落结构产生影响。【关键词】牙周炎；藏族；龈下微生物；16SrRNA；高原【中图号】R781.42【文献标识码】A 【DOI】10.20049/j.bjkqyx.1006-673X.2023.02.012Comparative analysis of subgingival microbiome between Tibetan and Han periodontitis patients DU Qi-lian，TANG Can，YUAN Xing，LI Zi-yan.Department of Stomatology,Hospital of Chengdu Office of Peoples Government of Tibetan Autonomous Region,Chengdu 610041,China【Abstract】Objective To compare the difference in the subgingival microbiome between Tibetan and Han periodontitis patients in Tibet.Methods Twenty Tibetan periodontitis patients and 19 Han periodontitis patients were enrolled.The Illumina MiSeq sequencing platform was used to perform 16SrRNA high-throughput sequencing of subgingival plaque,and the difference in the microbial community structure of the two groups was compared.Five Hans patients were selected to compare the changes in the subgingival microbial community structure.Results The subgingival microbial species richness and microbial diversity of the Han periodontitis patients was slightly higher than that of the Tibetans.Two months after the Tibetan Han periodontitis patients arrived in Chengdu,the species abundance and microbial diversity of the Tibetan Han periodontitis patients increased,but there was no statistical difference.Filifactor in Han patients was higher than that of the Tibetan.After the Han patients in Tibet returned to Chengdu Plain,Campylobacter and Eikenella increased significantly.Conclusions Ethnic and altitude factors may have an impact on the subgingival microbial community structure in patients with periodontitis.【Key words】Periodontitis;Tibetans;Subgingival microorganisms;16SrRNA;Plateau基金项目：西藏自治区自然科学基金（XZ2018ZRD-116）作者单位：610041 成都 西藏自治区人民政府驻成都办事处医院口腔科通信作者：杜启莲，E-mail：，电话：[phone]北京口腔医学 2023年第31卷第2期 Beijing Journal of Stomatology April 2023，Vol.31，No.2130探诊深度（probing depth，PD）4mm 或临床附着丧失（clinical attachment loss,CAL）2mm；X 线片示牙槽骨吸收超过根长 1/3；无糖尿病、甲亢、心血管等系统性疾病；无吸烟史；3 个月内未服用过抗生素，6 个月内未行牙周治疗。所有志愿者均签署知情同意书，本研究获得医院伦理委员会批准(批号：2018 科研第 44 号)。2.样本采集 口腔内每个象限各选取探诊最深的 1 个位点作为样本采集牙位，棉卷隔湿，气枪吹干牙面，先刮尽龈上菌斑，使用龈下刮治器刮取牙周袋内菌斑，将其置于含 1 ml 灭菌生理盐水的冻存管中，在 2 h内送至-80 冰箱中存放。其中有 5 例长期在西藏的汉族牙周炎患者，行2 次样本采集，第一次采集时间点是对象从西藏高原返回成都平原的第 1 周之内，第二次采集时间点是对象返回成都平原达2个月后。两次采集的位点相同。3.DNA 抽提和 PCR 扩增根 据 E.Z.N.A.soil 试 剂 盒(Omega Bio-tek,Norcross,GA,U.S.)说明书进行总 DNA 抽提，DNA浓 度 和 纯 度 利 用 NanoDrop2000 进 行 检 测，利用 1%琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 提取质量；用338F(5-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3)和806R(5-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3)引物对 V3-V4 可变区进行 PCR 扩增。4.Illumina Miseq 测序使用 2%琼脂糖凝胶回收 PCR 产物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen Biosciences,Union City,CA,USA)进行纯化，Tris-HCl 洗脱，2%琼 脂 糖 电 泳 检 测。利 用 QuantiFluor-ST(Promega,USA)进 行 检 测 定 量。根 据 Illumina MiSeq 平台(Illumina,San Diego,USA)标准操作规程将纯化后的扩增片段构建 PE 2300 的文库。构建文库步骤:连接“Y”字形接头；使磁珠筛选去除接头自连片段；利用 PCR 扩增进行文库模板的富集；氢氧化钠变性,产生单链 DNA 片段。利用 Illumina 公司的 Miseq PE300 平台进行测序。5.分析方法先根据原始序列的 barcodes 信息，运用 QIIME2 demux 插件对不同样本的序列进行拆分，将拆分后的序列，运用 QIIME2 dada2 插件进行质控，修剪，去噪，拼接，去除嵌合体后，得到了最终的特征序列表格。运用 QIIME2 feature-classifier 插件将 ASV的代表序列比对到预先训练好的 GREENGENES 数据库得到物种的分类信息表。Alpha 多样性指数被用于评估样本本身的多样性程度。结 果1.西藏藏族与汉族牙周炎的物种组成分析 通过 Illumina MiSeq 测序平台对 20 例西藏藏族和 19 例汉族牙周炎患者龈下菌斑 16SrRNA 基因（V3-V4 区）生物多样性检测，共计获得藏族 1939个 OTU，汉族 2128 个 OTU，两组共有的 OTU 为1030个，占48.4%53.1%。物种组成的Veen图见图1，汉族比藏族的物种组成略丰富，但二者差异不大。2.西藏汉族牙周炎到达成都 1 周内与 2 个月时龈下菌斑物种分析长期在西藏的 5 名汉族牙周炎患者从高原到平原 1 周内（A 组）和 2 个月后（B 组）样本的物种组成分析得出，A 组共计获得 757 个 OTU,B 组共计获得 867 个 OTU,两组共有的 OTU 为 520 个，占59.9%68.6%（图 2）。从图 2 可见，西藏汉族牙周炎患者从西藏高原到达成都平原后 2 个月比到达1 周时物种略丰富。3.西藏藏族与汉族牙周炎患者龈下微生物Alpha 多样性分析长期在西藏的藏族和汉族牙周炎患者龈下菌斑微生物 Alpha 多样性 shannon 指数显示（P 0.05），两组间无明显差异，但总体趋势为汉族牙周炎患者较藏族牙周炎患者的微生物多样性稍高（图 3）。4.西藏汉族牙周炎到达成都 1 周内与 2 个月时龈下菌斑 Alpha 多样性分析长期在西藏的汉族牙周炎患者从西藏高原到达图 1 西藏藏族和汉族牙周炎患者龈下菌斑物种组成 Veen 图北京口腔医学 2023年第31卷第2期 Beijing Journal of Stomatology April 2023，Vol.31，No.2131成都平原 1 周时（A 组）和 2 个月时（B 组）龈下菌斑微生物 Alpha 多样性 shannon 指数显示，在平原2 个月时（B 组）较到达平原时（A 组）具有更高的微生物多样性（图 4），但无统计学差异（P 0.05）。5.西藏藏族和汉族牙周炎患者龈下菌斑微生物群落结构差异和优势群种分析LEfSe 多级物种差异判别分析长期在西藏的藏族和汉族牙周炎患者龈下菌斑微生物物种差异显示，藏族牙周炎患者龈下菌斑微生物中乳酸杆菌（Lactobacillales）、杆 菌（Bacilli）、链 球 菌 属（Streptococcus）、无胆甾原体科（Acholeplasmataceae）比汉族有更高的丰度。而汉族牙周炎患者龈下菌斑微生物中消化链球菌科（Peptostreptococcaceae）、鞘脂单胞菌科（Sphingomonadaceae）、甲型变形菌纲（Alphaproteobacteria）、柄杆菌科（Caulobacteraceae）比藏族有更高的丰度，结果见图 5。6.西藏汉族牙周炎患者到达成都 1 周内和 2 个月时龈下菌斑微生物群落结构差异和优势群种分析长期在西藏的汉族牙周炎患者到达成都平原 2 个月后（B 组），龈下菌斑微生物中的弯 曲 杆 菌 科（Campylobacteraceae）、变 形 菌 纲（Epsilonproteobacteria）、艾肯氏菌属（Eikenella）具有更高的丰度，结果见图 6。7.牙周特定微生物属水平差异分析在牙周炎常见菌属分析中，西藏汉族牙周炎患者的产线菌属（filifactor）较藏族明显多（P 0.05），卟啉单胞菌属、梭菌属、坦纳菌属、普氏菌属、密螺旋体比藏族高，但无统计学差异(图 7）。西藏汉族牙周炎患者到达成都 2 个月后弯曲杆菌、艾肯氏菌明显增加（图 8）。讨 论有研究表明，口腔微生物的种类不仅与宿主有图 2 汉族牙周炎患者从西藏高原到达成都平原 1 周时和 2个月时龈下菌斑物种组成 Veen 图图 3 藏族牙周炎患者和汉族牙周炎患者龈下菌斑微生物 Alpha多样性 shannon 指数 图 4 汉族牙周炎患者从西藏高原到达成都平原 1 周时和 2个月时龈下菌斑微生物 Alpha 多样性 shannon 指数图 5 西藏藏族和汉族牙周炎患者龈下菌斑微生物 LDA 判别柱形图图 6 汉族牙周炎患者到达成都平原 2 个月后龈下菌斑微生物 LDA 判别柱形图北京口腔医学 2023年第31卷第2期 Beijing Journal of Stomatology April 2023，Vol.31，No.2132关，而且还受到饮食、生活习惯及水源等环境因素直接或间接影响5。西藏的藏族人群世居于青藏高原，常常进食牛羊肉和奶制品，西藏的汉族人群多因工作而移居高原，以汉式饮食为主。Hao 等6通过收集健康人群的唾液进行高通量测序分析，结果表明居住于低海拔地区人群、汉式饮食人群口腔微生物具有较高的微生物群落多样性和更丰富的物种组成，但组间统计学分析无明显差异，与本研究结果相似。本研究对象均为牙周炎患者，结果也表明汉族牙周炎患者的物种组成比藏族稍丰富，微生物多样性略高，同样组间无统计学差异。这也与马瑞等7的研究结果一致。高海拔环境具有低气压、低温、低湿度、高辐射等特点，相对于低海拔环境，微生物群落多样性有所降低6。本研究首次对汉族牙周炎患者从高海拔的西藏地区到达低海拔的成都地区后进行自身对比，结果也表明达到低海拔地区后 2 个月，同一个位点采集的菌斑，微生物物种组成更加丰富，微生物多样性增大。但因研究对象失联较多，最终样本研究例数较少，需今后加大样本量进一步深入研究和做出更科学的统计学分析结论。目前公认与牙周病有关的致病菌有：牙龈卟啉单胞菌、福赛坦纳菌、具核梭杆菌、中间普氏菌、齿垢密螺旋体等8,9，本研究分别进行了统计分析。结果表明，西藏汉族牙周炎的卟啉单胞菌属、梭菌属、坦纳菌属、普氏菌属、密螺旋体均比藏族高，但无统计学差异，只有产线菌属明显较藏族多。产线菌是革兰阳性专性厌氧线菌，被认为是包括牙周炎在内的各种口腔感染中的新兴病原体10，是一种新的牙周炎标志物11，分布于近牙周袋底部的软组织侧12。本研究中汉族牙周炎患者的产线菌属较藏族多，许多调查研究也表明移居高原者较世居者更易患牙周炎且程度更重3，说明移居高原的汉族牙周炎可能与产线菌属有关，还需要今后进一步深入研究证实。梭菌属是牙周炎特异性细菌13，刘静等14对比了青海藏族、回族、土族牙周病的可疑微生物，发现藏族与回族、土族相比不仅可疑微生物差别较大，而且种类单一，梭菌仅为藏族牙周病患者的可疑致病菌。Hao 等6研究结果也表明西藏高海拔地区的藏式饮食人群口腔微生物有更高丰度的梭杆菌门。而梭菌在本研究中结果与前二者不同，反而是西藏汉族比藏族梭菌高、西藏汉族达到成都 2 个月后梭菌增高，但统计学上无显著性差异性。本研究因样本量较少，还有待进一步研究。因海拔、气候等差异，平原与高原的牙周致病菌数量和种类的分布存在明显的差异。刘莉等15研究发现具核梭杆菌和伴放线放线杆菌在高原慢性牙周炎患者组的检出率高于平原的慢性牙周炎组。肖娴等16体外实验发现高压氧环境下，牙周袋的厌氧致病菌显著减少，杆菌、梭状菌和螺旋体比率明显减少，病原体的种类明显改变。本研究中优杆菌、消化链球菌均在 A 组较多，两种菌均是严格厌氧的革兰阳性菌，可能与高原缺氧有一定相关性。研究表明，直肠弯曲杆菌、侵蚀艾肯菌在中重度牙周炎中检出率较高17,18，牙周洁治后弯曲杆菌下降19，图 7 西藏藏族与汉族牙周炎患者特定菌群比较图 8 西藏汉族牙周炎患者到达成都 1 周时（A）与 2 个月时（B）特定菌群比较北京口腔医学 2023年第31卷第2期 Beijing Journal of Stomatology April 2023，Vol.31，No.2133变形菌门在健康牙周中的丰度较高20，本研究中B 组的弯曲杆菌、艾肯氏菌较 A 组高，变形菌是 B组的特征微生物，说明西藏汉族牙周炎患者达到平原后 2 个月，龈下微生物有一定的变化，但因样本量有限，还有待今后进一步深入研究。综上所述，本研究结果显示在物种丰富度和微生物多样性方面，西藏汉族比藏族略高，西藏汉族从高海拔的西藏地区到低海拔的成都地区后也略有增加。西藏汉族牙周炎患者较藏族的产线菌属高，到达低海拔地区后的弯曲杆菌和艾肯氏菌有所增加。本研究的不足之处在于西藏汉族牙周炎患者从高海拔到达低海拔地区的自身对比样本量及对照组样本量过少，有待今后加大样本量进行深入研究。参 考 文 献 1 杨万娟,徐杰.高通量测序技术在牙周微生物群落研究中的应用.医学综述,2020,26(20):4083-4087.2 任雯,赵梅,李杰,等.青少年唾液菌群结构的分析研究.北京口腔医学,2019,27(5):256-260.3 何雪娇,蒋俊强,罗勇军.高原地理环境与牙周炎的关系研究进展.国外医学医学地理分册,2015,36(2):102-104.4 武曦,张纲,冯晓丹,等.缺氧通过HIF-1抑制hPDLFs内毒素耐受.现代生物医学进展,2019,19(19):3611-3615.5 Renson A,Jones HE,Beghini F,et al.Sociodemographic variation in the oral microbiome.Ann Epidemiol,2019,35:73-80.6 Hao Y,Tang C,Du Q,et al.Comparative analysis of oral microbiome from Zang and Han populations living at different altitudes.Arch Oral Biol,2020,121:104986.7 马瑞,施文,易根云,等.牙周健康状况和民族因素对口腔微生物多样性的协同作用.口腔医学研究,2017,33(7):745-749.8 孟焕新.牙周病学.4版.北京:人民卫生出版社,2014.56-70.9 邹任杰,吴亚菲,申道南.牙周炎相关关键微生物的网络分析构建与预测.中华口腔医学杂志,2020,55(12):1005-1010.10 Oscarsson J,Claesson R,Bao K,et al.Phylogenetic analysis of filifactor alocis strains isolated from several oral infections identified a Novel RTX toxin,FtxA.Toxins(Basel),2020,12(11):687.11 Aja E,Mangar M,Fletcher HM,et al.Filifactor alocis:Recent Insights and Advances.J Dent Res,2021,100(8):790-797.12 程远,殷艳丽,赵蕾.龈沟产线菌的研究进展.国际口腔医学杂志,2014,41(5):593-597.13 吴芳,李俊平,汪珍珍,等.16S rRNA基因克隆文库分析比较牙周炎患者和健康人口腔唾液微生物多样性.微生物通报,2016,43(6):1295-1303.14 刘静,石晴,李志艳,等.青海土族、回族与藏族牙周病的可疑致病微生物差异分析.实用口腔医学杂志,2018,36(4):803-808.15 刘莉,吕俊,谭颖徽,等.高原地区与平原地区慢性牙周炎患者龈下菌斑中牙周致病菌差异的初步研究.国际口腔医学杂志,2014,41(2):149-152.16 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