MC3T3-E1细胞成骨模型的建立及局部黏着斑激酶表达的研究.pdf
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1、基金项目:国家自然科学基金(,);内蒙古自然科学基金();包头医学院 年研究生科研创新项目()通讯作者:张春阳【基础医学】细胞成骨模型的建立及局部黏着斑激酶表达的研究曹志威,邵国,赵志军,张春阳,(内蒙古科技大学包头医学院,内蒙古 包头 ;内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院神经外科;深圳市龙岗区第三人民医院转化医学中心;包头医学院神经外科疾病研究所;内蒙古自治区骨组织再生与损伤修复工程技术中心)摘要 目的:通过化学诱导手段建立 细胞成骨模型,探讨局部黏着斑激酶()基因表达与成骨细胞形成的关系,了解 对成骨分化的影响。方法:观察 细胞成骨诱导前后细胞形态,茜素红化学染色检测矿化情况,实时荧光定
2、量 检测成骨标志物 、的表达,同时分析 在成骨过程中的表达情况。结果:细胞成骨诱导 后细胞呈长梭形或多角形;第 、时,茜素红染色可见矿化结节;成骨标志物 、的表达呈持续升高的趋势,的表达总体呈升高趋势,在第 时略有下降。结论:的表达与成骨相关基因的表达趋势基本一致,提示 可能在 细胞成骨过程中发挥一定作用。关键词 细胞;成骨;局部黏着斑激酶 :,(,;,;,;,;):,:,年第 卷第 期 ,:;,:,;细胞(胚胎期小鼠颅顶处分离出的前骨细胞)是基础实验中最常用的成骨样细胞系之一,在体外可被当作一种理想模型来研究成骨细胞分化,通常应用于骨发育及修复等相关领域。研究者们在体外尝试使用不同配方的培养
3、基来诱导其成骨 ,并通过添加或减少某种细胞因子、药物或生物材料来评估其对 细胞的成骨作用 。局部黏着斑激酶(,)是蛋白酪氨酸激酶超家族中的一员,在大部分哺乳动物中均有表达,并且能通过多种途径参与调节细胞的黏附、迁移、增殖分化等 。本课题前期实验证实,在大鼠颅骨发育过程中的表达是逐渐升高的,在第 周时达到最高值,然后趋于稳定,并且该趋势与大鼠颅骨发育规律基本一致。这提示 可能作为大鼠颅骨快速发育的生物标志物之一。在此,我们应用成骨分化培养基建立了 细胞成骨模型,并通过茜素红化学染色和成骨相关基因的表达情况鉴定了该模型。此外,确定了 在该细胞诱导成骨过程中的表达规律,这一结果为探索小儿颅骨生长发育
4、过程中关键分子的变化,寻找小儿颅骨生长高峰期的生物标志物提供了实验依据。材料与方法 材料 细胞本实验选用 细胞(小鼠颅顶前骨细胞)购自武汉普诺赛生命科技有限公司(中国武汉,)。试剂 完全培养基(中国武汉普诺赛生命科技有限公司,);胰蛋白 酶 (美 国 公 司,);(美国 公司);细胞成骨诱导分化培养基(含 的 完全培养液 地塞米松 甘油磷酸钠 抗坏血酸)、茜素红()染料购自 中国赛业(广州)生物科技有限公司,;水(美国 公司,);总 提取试剂 (美国 公司,);异丙醇、无水乙醇(天津市永大化学试剂有限公司);氯仿(北京化学工业试剂公司);反转录试剂盒(美国 公司,);引物委托上海生工公司合成;
5、(中国北京康为世纪公司,)。方法 细胞成骨诱导 细胞在 培养箱中(设置温度 ,浓度为),使用含 胎牛血清、青霉素 钠盐和硫酸链霉素的 完全培养基培养。每隔 更换一次培养基。当细胞合并程度达 左右时,加入 胰蛋白酶 进行消化并传代。待细胞生长稳定后,将 细胞按 瓶接种到 的培养瓶中,每瓶加入 的 完全培养基,当细胞合并程度达 左右时,更换为 细胞成骨诱导分化培养基,前 内每 进行一次全量换液,后每隔 进行 次半量换液,直至 。整个培养过程中每隔 在显微镜下拍照并做好实验记录。茜素红化学染色 细胞以 孔的密度接种于六孔板中,每孔加入适量的 年第 卷第 期 完全培养基完全铺满孔板底部,然后将六孔板放
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