PLIN5通过p-AKT_p70S6K信号通路对肺癌细胞增殖的抑制作用.pdf

书书书基础医学论著基金项目：山东省自然科学基金（，）；烟台市科技计划（）；山东省大学生科技创新训练项目（）通信作者：孔丽君，：通过 信号通路对肺癌细胞增殖的抑制作用黄荣坤马颖郭若雨杨淑芯胡金霞孔丽君滨州医学院基础医学院生物化学与分子生物学教研室山东 烟台 【摘要】目的检测 在肺癌中的表达情况及作用，探讨其与 信号通路的关系。方法通过检索数据库资料结合免疫组化染色，分别在 和蛋白水平分析 在肺癌及癌旁正常组织中的表达差异。慢病毒感染过表达 和用 敲低 在肺癌细胞系 和 中表达后，活力检测细胞增殖能力变化；比色法检测细胞 含量变化；流式细胞术检测活性氧含量变化；检测 信号通路相关蛋白变化。结果公共数据库资料和免疫组化结果显示，与癌旁组织相比，在肺癌组织中 表达下调。过表达 后细胞增殖受到抑制，敲低 后细胞增殖能力上升。含量检测显示 降低细胞内 含量水平。活性氧含量检测显示 上调细胞内活性氧含量水平。降低 （），（），蛋白水平表达。结论 通过 信号通路在肺癌生长增殖中起抑制作用。【关键词】；肺癌；信号通路；增殖【中图分类号】【文献标志码】【文章编号】（）：，【】，（），（），（），【】；虽然肺癌的发病率和死亡率在持续下降，但仍是造成癌症死亡的主要因素 。代谢重编程是肿滨州医学院学报 年 月第 卷第 期 ，瘤的标志之一，脂滴包被蛋白 （，）在氧化性强的组织中通常高表达，被认为在脂滴的生物发生、脂肪酸的合成与分解代谢调节中发挥重要作用 。然而，在肺癌发生中的作用尚未见报道。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（，）信号途径受到多种细胞信号的调控，包括有丝分裂生长因子、胰岛素等激素、营养素（氨基酸、葡萄糖）、细胞能量水平和应激条件，并在细胞增殖、凋亡、葡萄糖代谢以及蛋白质合成中发挥调节作用 。细胞代谢的改变可以影响 信号途径的激活，反之，信号的活化状态也可以调控细胞代谢和细胞生长 。本研究将检测 在肺癌中的表达情况以及对肺癌细胞生物学功能的影响，同时探讨 与 信号途径间是否存在调控关系。材料与方法 实验试剂 基础培养基、胎牛血清、胰蛋白酶均购自武汉普诺赛生物科技有限公司；兔二步法试剂盒、封闭用羊血清均购自北京中杉金桥公司；、二甲基亚砜（）均购自 公司；试剂盒购自碧云天生物科技；活性氧检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；含量比色法测试盒购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有 限 公 司。兔 抗 人 ，（），（），抗体购自 。细胞培养人非小细胞肺癌细胞系 、细胞均从 购买。均用含 胎牛血清（，）的 基础培养基在 、含 的培养箱中培养。免疫组化肺癌组织和癌旁组织固定后进行脱水、包埋和切片。切片置于 烤箱中 脱蜡，二甲苯溶液浸泡 次，每次 ，梯度乙醇水化，每次 ，蒸馏水冲洗 。抗原修复液高压修复 ，自然冷却至室温，洗 次 。内源性过氧化物酶阻断剂浸泡，室温孵育 ，洗 次 。山羊血清 封闭，一抗 孵育（湿盒内）过夜，洗 次 。二抗 封闭，洗 次 。显色，苏木素染色 ，蒸馏水洗 。盐酸酒精分化 ，蒸馏水洗 ，温水返蓝 。脱水透明后中性树胶封片，显微镜下观察拍照。实验在肺癌细胞中过表达和敲低 ，后收集细胞，根据细胞量加入蛋白裂解液后置于冰上裂解 ，每隔 吹打 次。离心 后收集上清液，按比例加入 ，加热 ，冷却后备用。聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白后电转至 膜上，脱脂奶粉封闭 。一抗于 摇床上孵育过夜，溶液清洗次，每次 ，二抗 摇床孵育 。溶液清洗 次，每次 ，化学发光法检测信号。检测细胞增殖 将过表达和敲低 后的细胞种于 孔板中，每孔 个细胞，每组 个复孔。待细胞完全贴壁后在 、时，每孔避光加入 的 试剂，继续培养 后避光取出。使用酶标仪在波长 处检测待测样品的吸光度值，记录数值绘制增殖曲线。流式细胞仪检测细胞活性氧含量细胞去除培养基，按照 比例加入用无血清培养基稀释的 ，培养基盖住细胞。孵育 。无血清培养基洗涤细胞 次后收集细胞，流式细胞仪检测荧光，用 的参数检测 。含量测定细胞按照每 个加入 试剂一提取液，超声破碎细胞后沸水浴 ，冷却后离心取上清液。将 样本上清和 测定工作液加到 管中，孵育 。加入 试剂五，混匀后离心取上清液。取 上清液加入酶标孔中，继续加入 显色剂工作液，酶标仪震荡 后静置 ，加入 试剂八。酶标仪震荡 后静置 ，于波长 处测定各孔吸光度值，根据吸光度值求出 含量。统计学方法应用 软件进行分析，组间比较采用 检验。为差异有统计学意义。结果 在肺癌组织中表达降低通过 网站对 数据库和 数据库资料进行分析（：）发现，与正常肺组织相比，非小细胞肺癌中最主要的肺腺癌和肺鳞癌组织中 在 水平上表达均降低（图 ）。进一步通过 数据库分析 表达量与肺腺癌患者预后相关性发现，在肺腺癌中 低表达患者相比高表达患者生存期显著降低（图 ）。而罹患肺鳞癌的患者中，表达量与预后无相关性（图 ）。本研究进一步分析 数据库肺腺癌患者资料发现，、期肿瘤组织中 表达比期肿瘤组织更低（，滨州医学院学报 年 月第 卷第 期 ，），期肿瘤与 期相比尽管 表达更低，但差异无统计学意义（）（图 ）。在存在 突变的肿瘤组织比 未突变组 表达更低（）（图 ）。正常肺组织与肺腺癌、肺鳞癌组织中 的表达差异；肺腺癌患者 表达与预后的相关性；肺鳞癌患者 表达与预后的相关性；肺腺癌患者不同分期与 表达；表达与 突变的相关性。图 在肺腺癌组织和正常组织中的表达 过表达和敲低 后蛋白水平表达为了进一步确定 在肺腺癌和癌旁组织中的表达差异，本研究应用免疫组化检测 在蛋白水平的表达情况发现，在癌旁组织中表达水平高（图 ）在肺腺癌组织中 表达显著下调（图 ）。为在细胞水平上研究 对肺癌恶性表型的影响，用 慢病毒及对照 慢病毒感染 细胞，随后开展功能获得实验，将靶向 的 及对照 转染进 细胞中，进行功能缺失实验。后收集细胞在蛋白水平检测 过表达或敲低效率，结果显示，在 细胞中 可被明显过表达（图 ），而在 细胞中，被显著敲低（图 ）。免疫组化检测 在癌旁组织的表达，；免疫组化检测 在肺腺癌中的表达，；细胞转染过表达质粒，检测 蛋白表达；细胞转染 后，检测 蛋白表达。图 在癌旁组织、肺腺癌组织和 、细胞系中的表达滨州医学院学报 年 月第 卷第 期 ，抑制肺腺癌细胞增殖并降低 含量和升高活性氧含量细胞增殖失控是肿瘤的显著特征，为探讨 对肺癌细胞增殖是否有影响，采用 活力实验检测过表达和敲低 后细胞增殖速度，结果显示，细胞过表达 后细胞增殖受到抑制（图 ），细胞敲低 后细胞增殖加快（图 ）。已被证实可以介导脂滴和线粒体的相互作用。因而对脂质的代谢和线粒体功能都有调控作用。为明确 对线粒体功能的影响，本研究检测了 被过表达或敲低后细胞 和活性氧含量的变化。过表达可致肺癌细胞内的 含量降低（图 ），而敲低 后细胞 含量增加（图 ）。活性氧含量测定实验显示过表达 后肺癌细胞内活性氧含量增加（图 ），敲低 后则活性氧含量减少（图 ）。这表明，能降低 含量，并增加活性氧含量。过表达 对肺腺癌细胞增殖的影响（）；敲低 对肺腺癌细胞增殖的影响（）；过表达 后肺腺癌细胞内 含量变化（）；流式细胞术检测肺腺癌细胞内活性氧含量变化。，。图 过表达和敲低 对肺腺癌细胞增殖、含量和活性氧含量的影响 调控 通路相关蛋白表达为分析 与 信号途径的关系，本研究检测了过表达和敲低 后 和 等的表达发现，过表达 后 （）、（）和 蛋白的表达水平降低，而敲低 后上述蛋白表达上调（图 ）。这表明，可以抑制 信号通路的激活，进而抑制肺腺癌细胞的增殖。图 过表达和敲低 后 （）、（）和 蛋白表达情况滨州医学院学报 年 月第 卷第 期 ，讨论代谢重编程是包括肺癌在内的癌症的标志之一，肿瘤细胞为了能够更迅速地增长繁殖会改变其代谢碳水化合物、脂质和蛋白质的能力 。尽管之前癌症代谢失调的研究主要集中在糖代谢和氨基酸代谢方面，但脂质代谢的重要性被越来越多的研究者注意到 。脂滴相关蛋白参与脂滴的形成、成熟、分泌和运输，并在脂质代谢调节中发挥重要作用 。脂滴相关蛋白中最重要的是 蛋白。蛋白家族由五个成员组成，主要分布在氧化代谢旺盛的组织中，是参与脂解作用的磷蛋白 ，。目前对 的研究主要集中在其与脂类代谢的关系方面 。在肿瘤中的表达及意义研究较少，有研究认为 启动子甲基化是卵巢癌发展中的关键分子标志 。然而，也有研究发现 在肝细胞癌里有表达，并起到促癌因子的作用。在肝癌细胞 里过表达 可以抑制活性氧生成，促进线粒体 脂滴相互作用，促进线粒体相关蛋白的表达 。本研究发现，在肺腺癌中表达水平降低，并促进活性氧生成，抑制细胞增殖。这表明，在不同组织起源的癌症中可能起到相似的作用。在肝癌中之所以起促进作用可能是由于 提高了脂质在肝细胞中的含量水平，而脂质含量的升高是非酒精性脂肪肝病和肝癌发生的促进因素。多种肿瘤中的活性氧增加，并且在肿瘤发生发展中发挥多种作用，例如，激活促肿瘤信号的传导、驱动 损伤和遗传不稳定 。活性氧同样可以促进抗肿瘤信号传导，启动氧化应激诱导的细胞死亡 。肿瘤中自由基清除酶减少、葡萄糖代谢增加、线粒体增加、氧化酶和脂肪加氧酶产生氧化剂都会导致活性氧水平的升高 。是细胞生长和代谢的主要调控分子，生长因子或营养物可激活该途径，从而驱动代谢重编程 。该通路在肿瘤发生发展中通常起促进作用，可通过调控细胞周期、自噬、铁死亡等多种机制促进细胞增殖 。血管损伤后，通过与 相互作用抑制血管平滑肌细胞的增殖和迁移。本研究发现，的表达变化可以调控 信号途径的激活，其 过 表 达 使 得 （），（），蛋白下调，显示 通过抑制该途径，抑制肺癌细胞的增殖。综上所述，在肺癌组织中表达下调，且 高表达患者的预后好，同时 抑制肺癌细胞增殖能力，降低 含量和提高活性氧含量。这表明，在肺癌的发生中起抑制作用。参考文献 ：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，：，（）：，：，：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，：，（）：，：，（）：（下转第 页）滨州医学院学报 年 月第 卷第 期 ，：，（）：，：（），（）：，（）：任卫东，刘爽，马春燕，等 斑点追踪成像评价急性心肌梗死及慢性缺血性心力衰竭患者左心室扭转 中国介入影像与治疗学，（）：，（）：殷哲煜，董晓秋，刘宏宇，等 斑点追踪技术评价冠状动脉搭桥术后心肌功能的临床价值研究 现代生物医学进展，（）：，（）：于蓝，王银荣，田永梅，等 三维斑点追踪成像技术评价急性前壁心肌梗死患者左心室收缩功能 中国医学影像学，（）：，（）：，（）：付丽，董茜，韩晓涛，等 不同年龄急性 段抬高型心肌梗死患者临床及冠状动脉病变特点 中国医药，（）：刘美丽，黄光华，李娜，等 不同年龄组女性急性 段抬高型心肌梗死患者直接经皮冠状动脉介入术疗效评价 临床军医杂志，（）：封赞祥，侯芳，刘宝辉，等 主动灌注与分流栓在猪急性心肌缺血模型中心肌保护作用比较 滨州医学院学报，（）：，（）：，：，（）：，（）：赵婉婉，段利科，姜沙沙，等 心肌声学造影评估存活心肌的临床价值 医学综述，（）：（收稿日期：）（本文责编：李林）（上接第 页），（），（）：，（）：，：，：，：，（）：，：，（）：，：，（）：（收稿日期：）（本文责编：李林）滨州医学院学报 年 月第 卷第 期 ，