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线粒体DNA介导先天免疫反应在肠缺血再灌注损伤中的研究进展.pdf
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1、综述与进展J Med Res,February 2024,Vol.53 No.2线粒体DNA介导先天免疫反应在肠缺血再灌注损伤中的研究进展景祎馨张贻帼潘锐丁可孟庆涛摘要肠缺血再灌注损伤是一种常见的组织器官损伤类型,具有高发生率及病死率的特点,其致病因素与机制复杂。研究表明,线粒体DNA(m i t o c h o n d r i a l D NA,m t D NA)释放在肠缺血再灌注损伤中起关键作用,由于共同的进化起源,mtDNA具有与细菌DNA相似结构被认为是先天免疫系统激动剂。在外部环境或细胞自身刺激下,受损线粒体可释放mtDNA进入胞质或循环,激活先天免疫多个模式识别受体以触发促炎或I型
2、干扰素反应。本文重点讨论了mtDNA的跨膜释放机制以及mtDNA介导先天免疫信号通路在肠缺血再灌注发生、发展中的作用,为缺血再灌注疾病的相关研究提供理论依据。关键词线粒体DNA先天免疫肠缺血再灌注损伤中图分类号R365肠缺血再灌注(intestinal ischemia reperfusion,IIR)损伤是临床常见的一种损伤,可发生在多种病理生理条件下,例如急性肠系膜缺血、严重创伤、急性休克、小肠移植和败血症。在缺血期间,组织缺氧导致内皮细胞屏障功能受损和血管通透性增加,随后在再灌注期间血流和氧气的恢复导致细菌易位、组织损伤、炎性反应和氧化应激。除肠道局部损伤外,IIR还可引起肠道菌群移位、
3、内毒素血症及远端器官损害,最终导致全身炎症反应综合征、多器官功能障碍综合征甚至死亡1IIR损伤的病理进程中,线粒体已经成为关键的参与者和调节者。线粒体作为大多数真核细胞内必不可少的细胞器,主要通过氧化磷酸化产生ATP供应能量。线粒体拥有独立于细胞核的遗传物质线粒体DNA(mi t o c h o n d r i a l D NA,mt D NA),人类的mtDNA由高度保守的轻链及重链组成环状结构,共编码了氧化磷酸化相关的13种 mRNA、2 种rRNA 以及2 2 种tRNA2。内共生学说认为线粒体来源于真核生物吞噬的细菌,因此mtDNA与细菌基因具有结构的相似性,释放到细胞质或循环中的mt
4、DNA可作为“外来”分子被先天免疫系统中不同模式识别受体识别,从而触发I型干扰素(interferon,IFN)及促炎反应3。本文讨论了mtDNA释放到胞质或循环中的可基金项目:国家自然科学基金资助项目(8 2 17 2 155)作者单位:430 0 6 1武汉大学人民医院麻醉科通信作者:孟庆涛,电子信箱: 160 文献标识码AD0110.11969/j.issn.1673-548X.2024.02.031能机制,重点关注了mtDNA触发的免疫反应在IIR损伤的作用,主要涉及Toll 样受体9(Toll-like re-ceptor9,TLR9)、环状 CMPA M P合成酶(cyclicGM
5、P-AMP,cGAS)和NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白 3(NOD-like receptor thermal protein domainassociated protein3,NLRP3)信号通路。一、mtDNA的跨膜释放机制1.mtDNA胞质释放机制:在生理情况下,mtDNA主要存在于线粒体基质内,缺氧、败血症、外伤或线粒体膜电位剧烈变化等刺激可造成mtDNA穿越线粒体膜而转移到胞质中,这个过程与线粒体膜的结构与功能密不可分3。目前已有研究显示多种线粒体膜孔道参与了mtDNA的胞质易位。(1)线粒体通透性转换孔:线粒体通透性转换最初由Haworth和Hunter提出,他们发现高水平的钙
6、会引起线粒体内膜通透性的增加4。随着进一步研究证实,这一现象由一种组装在线粒体膜上的分子实体支持一一线粒体通透性转换孔(mitochondrial permea-bility transition pore,mPTP),该孔道直径为2 3nm,可允许水及小于1.5kDa的溶质通过5.6 。mPTP开放除了允许代谢物流出外,也可介导mtDNA的释放。线粒体在受到Fe2+、H,O,和钙离子诱导的氧化应激刺激下,mtDNA的部分片段会通过mPTP离开线粒体7 。同样在小鼠脑线粒体中发现,辐射诱导的氧化应激会引起mtDNA氧化损伤及片段化,而且还会使mPTP自发打开和关闭的频率增加,促进mtDNA片段
7、易位到细胞质8 。mPTP介导的医学研究杂志2 0 2 4年2 月第53卷第2 期mtDNA 的胞质释放在多种炎性疾病中得到广泛研究。在肌萎缩性侧索硬化症模型中,一种核DNA/RNA结合蛋白TDP43可错位进入线粒体,打开mPTP导致 mtDNA泄漏到细胞质中,从而进一步驱动cGAS介导的免疫信号9(2)BAK/BAX孔:Bcl-2蛋白家族是细胞调亡的关键调控因子,目前已发现18 种同源蛋白,其中BAX与BAK是关键的促凋亡蛋白10 。在生理情况下,BAX和BAK主要以无活性的单体形式存在,但在细胞调亡进程中,BAX/BAK会发生积聚并插人线粒体外膜,经历构象重排与低聚等过程形成孔道,释放细胞
8、色素c等促调亡因子以激活半胱天冬酶级联反应,最终导致细胞收缩、染色质缩合和调亡体形成。线粒体外膜形成的BAX/BAK孔隙不仅仅参与细胞凋亡的激活,近年来研究显示,BAX/BAK孔介导的mtDNA释放可激活先天免疫信号的转导。使用晶格光片活细胞显微镜观察调亡细胞线粒体发现,线粒体外膜出现的BAK/BAX孔可允许携带mtDNA的线粒体内膜膨出,随后线粒体内膜发生透化释放mtDNA进入胞质12 。在膜孔道的组装过程中,BAX与BAK会形成单独的线、弧和环状结构,这些弧和环状结构与膜孔的形成密切相关。此外BAX与BAK之间可进行相互调节,促进彼此组装,两者的组装速率是mtDNA释放动力学的主要决定因素
9、13(3)电压依赖性阴离子通道:电压依赖性阴离子通道(voltage dependent anion channel,VDAC)是线粒体外膜上嵌人的-桶状蛋白,控制着线粒体代谢物质的进出。VDAC可以在氧化应激条件下发生低聚,并且VDAC的低聚体可以形成大的线粒体外膜透化孔。在活细胞中,VDAC1或VDAC3 的低聚都有助于线粒体外膜透化并促进mtDNA的释放,此外,高效的VDAC1低聚化抑制剂VBIT-4抑制了mtDNA的流出。VDAC1的N端结构域包含3个带正电荷的残基可以与mtDNA的负电荷骨架相互作用,同时mtDNA可能会进一步促进VDAC1寡聚化,两者之间的相互作用可进一步促进VDA
10、C低聚并增加mtDNA释放14。2.mtDNA细胞外空间释放机制:mtDNA可以释放到细胞外,在血浆和血清、脑脊液或滑液等多种体液中都观察到了循环mtDNA的存在,循环中存在的mtDNA水平与炎症性疾病、癌症、衰老、创伤或组织损伤密切相关15综述与进展(1)细胞外陷阱:以中性粒细胞外陷阱(neutro-phil extracellulartrap,NET)为例,NET是中性粒细胞激活后释放到胞外的网状超微结构,主要由DNA骨架及附着的颗粒蛋白及肽类组成,NET可以直接捕获致病微生物,是抵御微生物入侵机体的一道防线16.17 。尽管NET中的大部分DNA来自细胞核,但这些结构中也包含mtDNA1
11、8。有研究显示,激活后的中性粒细胞会以ROS 依赖性方式释放仅含有mtD-NA的NET19。与NET类似,巨噬细胞可以产生由mtDNA组成的巨噬细胞外陷阱,从而抵御微生物入侵及扩散2 0 。同样在嗜酸性粒细胞及嗜碱性粒细胞中也发现含有mtDNA 的细胞外陷阱形成2 1,2 。(2)细胞外囊泡:细胞外囊泡(extracellularvesi-cles,EV)是一种细胞膜衍生结构,通常分为外泌体、微泡和调亡小体3个亚型2 3.2 4。EV可以携带特定的蛋白质、脂质或基因片段,在细胞间成分交换与信号转导等方面发挥着重要作用2 5。在慢加急性酒精性肝损伤中,循环中含有 mtDNA 的EV 的水平增加,
12、并且与中性粒细胞增多症和肝毒性密切相关。在慢性心力衰竭患者,血浆来源的携带 mtDNA 的外泌体增加可通过 TLR9 途径引发炎性反应,并且这种炎症的作用程度与外泌体mtDNA拷贝数密切相关2 6 。同样,在抗磷脂抗体刺激后,含mtDNA的EV水平会增加可通过TLR9受体引起内皮细胞的活化,从而增加先兆子痫的风险2 7 二、IIR损伤中mtDNA介导的先天免疫信号通路线粒体是缺血再灌注病理进程的重要参与者和调节者,线粒体功能障碍会通过氧化应激,炎症和凋亡加剧IIR损伤。在IIR期间,受损的线粒体所释放mtDNA是内源性损伤相关分子模式的重要来源,可激活TLR9,cGAS和NLRP3等先天免疫的
13、传感器以增强促炎和I型干扰素反应2 8 1.TLR9:TLR9是第一个发现对胞质DNA有反应的特异性受体,TLR9位于内质网中,可以识别DNA的低甲基CpG序列,mtDNA的低聚化 CpG序列是TLR9的有效激活剂2 9。与DNA结合后,TLR9会通过衔接蛋白MyD88发出信号,在核因子kB(n u c le-ar factorkappa-B,NF-kB)的存在下激活促炎性细胞因子的转录,此外还可通过干扰素调节因子7 的磷酸化导致I型干扰素基因的激活30 。TLR9已被证明在肝脏IR 期间的加剧先天免疫反应,而TLR9的抑制可扭转肝脏损伤31。有研究发.161综述与进展现,在肝细胞受到凋亡刺激
14、时,Bak/Bax孔介导的mtDNA释放会诱导TLR9依赖性IFN-产生。此外,在急性肺损伤中mtDNA可以通过激活TLR9/NF-kB通路介导随后的炎性反应32 。在肠组织中,创伤导致的细胞破坏可以释放mtDNA至循环中,通过激活中性粒细胞TLR9受体介导促炎性细胞因子的释放加剧肠道功能障碍3.34。但矛盾的是,Slone等35 通过对TLR9基因敲除小鼠进行IR后,检查肠组织损伤及炎性相关指标后发现TLR9在IIR诱导的组织损伤及炎症中似乎是可有可无的。因此,mtDNA触发TLR9信号转导的炎性反应可能有组织器官差异性,仍需要进一步研究。2.cGAS:大量研究已经证实,cGAS信号轴可响应
15、外源或内源DNA刺激而调节I型干扰素的产生。在没有DNA刺激的情况下,cGAS会以自抑制状态存在。当cGAS检测到DNA后可利用GTP和ATP作为底物,催化第二信使cGAMP的合成,随后cGAMP与位于内质网的干扰素基因刺激因子(stimulator of in-terferon genes,STING)结合并诱导构象变化,活化的STING 与 TANK 结合激酶1(TANK-binding kinase1,TBK1)结合,进而磷酸化干扰素调节因子3(inter-feron regulatory factor3,IRF3),随后IRF3二聚化并易位到细胞核。此外STING还可招募并激活IkB激
16、酶,从而诱导NF-kB易位到细胞核,进人细胞核的NF-kB与IRF3可以与其他转录因子一起发挥作用,诱导干扰素和炎性细胞因子的表达。尽管激活cGAS的大多数内源性DNA都认为来源于核基因,但目前有多项研究证实,mtDNA也可用作为cGAS配体。Guo 等36 研究显示,向玻璃体内注射mtDNA可导致细胞损伤和视网膜功能障碍,这一机制主要与mtDNA激活cGASST I NG 通路诱导炎性反应密切相关。此外,在牙本质细胞炎症及肾损伤等疾病中也观察到mtDNAc G A SST I NG 通路激活。在有关IR的研究中,cGASST I NG 信号转导参与了mtDNA诱导的坏死性调亡,mtDNA可通
17、过诱导坏死性调亡进一步促进IR损伤,而STING敲除可改善mtDNA诱导的肠道损伤。此外,mtDNAc G A S-STING的激活可通过诱导过量脂质过氧化而加重肠道损伤,在该研究中,mtDNA可以以剂量和时间依赖性的方式诱导脂质过氧化和细胞死亡,这一过程可通过 STING的敲除而逆转。针对mtDNA一cGAS-STING信号轴的靶向治疗可显著减轻IIR损伤。使用线粒体靶向抗氧化剂减 162J Med Res,February 2024,Vol.53 No.2轻DNA损伤或DNase-1降解细胞外DNA可以有效改善IR损伤。STING作为通路关键调节蛋白,STING的敲除可有效改善IIR中mt
18、DNA引起的损伤,此外,STING的抑制剂已经在小鼠肾缺血再灌注保护中得到广泛应用,因此STING在IR预防及治疗的作用值得进一步探究。3.NLRP3:NLRP3是一种NLR家族的关键受体蛋白,NLRP3的激活可吸引ASC和caspase-1组装成炎性小体,从而诱导caspase-1自切割和活化。活化的 caspase-1一方面促进IL-1和IL-18 等炎性细胞因子的成熟和分泌,另一方面还可切割GSD-MD引发焦亡,最终导致缺血再灌注的损伤。NLRP3激动剂不仅包括病原体相关的RNA、D NA、成孔毒素和肽聚糖,mtDNA也是 NLRP3 的有效激动剂。既往研究提出,氧化的mtDNA易位到胞
19、质后可直接导致NLRP3炎性小体激活,增加IL-1的分泌。Xian等37 进一步验证了在线粒体中,氧化的mtDNA要么被DNA糖基化酶 OGG1 修复,要么被内切酶FEN1切割成50 0 6 50 bp片段,这些片段通过mPTP和VDAC依赖性通道离开线粒体以启动胞质NLRP3炎性小体活化,并导致了促炎性细胞因子的释放。尽管目前缺乏IIR损伤中mtDNA激活NLRP3炎性小体的直接证据,但已有多项研究证实NLRP3炎性小体在IIR期间的损伤作用。一方面,NLRP3可以以GSDMD依赖性方式诱导焦亡加剧IIR损伤,另一方面,NLRP3活化所介导的炎性细胞因子生成也促进了IIR损伤。mtDNA-N
20、LRP3通路激活是IIR损伤的可能机制之一。研究显示,VX7 6 5作为一种选择性caspase-1抑制剂,可有效抑制NLRP3炎性小体活化,VX-765预处理可以有效减轻IIR期间的氧化损伤及炎性反应。此外,靶向mtDNA氧化损伤及释放也可有效推进IIR损伤治疗进展。特异性内切核酸酶1可将氧化的mtDNA切割成小分子片段,其抑制剂FEN1-IN-4可减少mtDNA碎片化,mPTP抑制剂CsA与VADC孔抑制剂VBIT-4可有效减少mtD-NA向胞质释放,而上述抑制剂在小鼠模型中均有效抑制了下游NLRP3炎性小体活化及炎性细胞因子释放,减弱了组织损伤,但未来仍需要进一步的实验验证其临床可行性。
21、四、展望IIR常见于急性肠系膜缺血、创伤、感染性休克、烧伤以及外科操作等,线粒体与肠缺血再灌注损伤的医学研究杂志2 0 2 4年2 月第53卷第2 期发生、发展密切相关。研究发现线粒体的生理功能不单单局限于能量的生成,在外界或自身刺激下,线粒体自身基因组mtDNA可作为一种损伤相关分子模式激活TLR9、c G A S及NLRP3信号通路,诱导干扰素及炎性细胞因子的释放从而进一步加重IIR。在这个过程中,mtDNA必须跨越线粒体内外膜才能到达线粒体外,其可能的机制主要包括了以mPTP、BA K/BA X孔和VDAC孔为主的胞质释放途径,以细胞外陷及EV为主的胞外释放途径,但目前有关mtDNA释放
22、通路的具体机制尚未完全阐明。此外,释放后的mtD-NA如何特异性筛选并结合模式识别受体也有待于进一步研究。利益冲突声明:所有作者均声明不存在利益冲突。参考文献1梅峻豪,张嘉伟,李绍钦,等线粒体自噬在肠缺血再灌注损伤中的作用及机制研究进展J】南京医科大学学报:自然科学版,2 0 2 2,42(8):118 8-11912Bestwick ML,Shadel GS.Accessorizing the human mitochondrialtranscription machinery J.Trends Biochem Sci,2013,38(6):283 2913West AP,Shadel GS
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