本科毕业论文---响应面法优化超声提取肉苁蓉蛋白质工艺研究.doc

学 年 论 文

题 目： 响应面优化超声提取肉苁蓉
蛋白质的工艺研究
学 院： 生 命 科 学
专 业： 生 物 科 学
学生姓名： 白 金 金
学 号： 201174050101
指导教师： 张 继

简短
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指导教师签字：

响应面法优化超声提取肉苁蓉蛋白质工艺研究

摘要：为优化肉苁蓉蛋白质的超声浸提工艺，采用响应面法对肉苁蓉蛋白质提取工艺进行了优化.采用4 因素3 水平的响应面分析法，4 因素分别为液料比、提取时间、超声清洗仪作用功率和温度。建立了一个肉苁蓉蛋白质得率与影响因子的多元二次回归方程，得到肉苁蓉蛋白质的最佳提取工艺条件：料液比1:20，提取时间44min，温度60℃，超声清洗仪作用功率90%，实际测得的肉苁蓉蛋白质得率为19.12%。
关键词：肉苁蓉;蛋白质; 响应面分析;超声浸提　
Optimization of Microwave-water extraction of protein from dried
Herba Cistanche using response surface methodology
Bai jin-jin
Guidance teacher: Zhang ji
(College of Life Science,Northwest Normal University,Lanzhou, Gansu,China ,730070)
Abstract：Microwave-water technique was applied for protein extraction from dried Herba Cistanche and the effects of processing parameters on extraction efficiency was optimized using response surface methodology (RSM). Four independent variables were investigated, including the ratio of water to raw material (mL/g),extraction time (min),Microwave power (%) and temperature (℃). A quadratic polynomial mathematical model with good correlation was constructed and employed to the optimization. The optimiaed extraction conditions were determined as: the ratio of water to raw material as20:1, extraction time of 44min,and temperature of 60℃,under which the experimental extraction yield of crude Herba Cistanche protein was19.12%.
Key words: Herba Cistanche;protein;response surface methodology (RSM);Microwave-water extraction
0. 前言
肉苁蓉（Herba Cistanche)为列当科（Orobanchaceae)植物肉苁蓉（Cistanche deserticolaY.C.Ma)的带鳞片的干燥肉质茎，又名苁蓉、大芸、金笋、地精[1]。肉苁蓉属于寄生植物，全世界约有二十种，中国有六种及一个变种。肉苁蓉适合生长在荒漠地区的盐碱地和沙漠中，主要分布在亚洲的中国西北部新疆、甘肃、内蒙古、宁夏等地及前苏联、阿富汗、内蒙[2]。肉苁蓉具有很多药用价值，例如增强机体免疫功能，抗衰老作用，通便作用，抗动脉粥样硬化作用以及对神经系统和性功能的影响。全面了解肉苁蓉的研究进展,对我国当前开发西部、培育、利用我国西部特有的中药资源有十分重要的意义[3]。
据分析化验肉苁蓉的营养成分有:总糖23-26%,油脂含量0.65-0.66%,蛋白质为20.6-19.3%,五氧化二磷每100克含160-133毫克,灰分5.1-57.5%,同时含有硅、锰、锶、锗、锌、钙等23种矿物质及微量元素[2]。这些矿物质及微量元素对于人体的健康极为有益，因此肉苁蓉在营养保健方面也具有很大的开发利用价值。
在测定粗提液中可溶性蛋白质的总含量时，由于植物粗提液中含有许多其他物质，如酚类物质、核酸等，而且蛋白质的含量比较低，因而诸如Folin -酚法，双缩脉法，紫外吸收法等的应用受到了一定的限制，而考马斯亮蓝法灵敏度高，操作简便，特异性强，快速，且不受酚类物质的影响，因而常常在对植物组织粗提液中可溶性蛋白质含量的测定时被采用[4]。
超声波是指频率高于2×104Hz的声波，是可在弹性介质中传播的一种机械波.从微观上讲，超声波可以与介质分子相互作用；宏观上，超声波可在流体中产生空化作用、热效应、冲击力等综合效应。超声波现已广泛用于高分子化合物的降解、有机合成、提取分离等方面，如从青蒿中提取青蒿素、从盐藻中提取胡萝卜素[5]。
响应面方法（response surfX1ce methodology，RSM）是Box 在20 世纪50 年代提出的，利用合理的试验设计并通过实验得到的一定数据，采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数，解决多变量问题的一种统计方法。较传统的正交分析法更为简便、直观，是目前工艺条件优化的重要方法之一[3]。
近年来发展起来一些新型提取技术，如微波辅助浸提、超声波辅助浸提等，这些方法能大幅度提高产品得率。本文使用超声波辅助浸提法对传统肉苁蓉蛋白质提取工艺加以优化，以期为肉苁蓉蛋白质提取工艺提供参考依据。
1.试验材料与方法
1.1 试验材料
肉苁蓉购自内蒙古，自然晾干，然后粉碎。牛血清蛋白(13SX1 )为华美生物工程公司的进口分装，考马斯亮蓝G- 2 50(为上海医药集团公司进口分装)，95%乙醇，85%磷酸等均为分析纯。
1.2 试验设备
TU-1901 双光束紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司； KQ-250DE数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；DD-5M湘仪离心机，湖南星科科学仪器有限公司；真空干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 肉苁蓉蛋白质浸提工艺流程
肉苁蓉→整理去杂→粉碎→超声浸提→离心取上清液→抽滤→浓缩→干燥→多糖、蛋白质
1.3.2 蛋白质含量的测定
采用考马斯亮蓝比色法，以牛血清蛋白为标准品[6]。
1.3.2.1 蛋白质标准溶液的制备
精确称取牛血清白蛋白100.00 mg，用少量蒸馏水溶解定容至100 mL，即为1.0 mg/mL 蛋白质标准液，4 ℃~5 ℃冰箱中保存备用.
1.3.2.2 考马斯亮蓝G- 250 溶液的制备
精密称取考马斯亮蓝G- 250 100.00 mg 加入95 %乙醇50 mL，再加入85%磷酸100 mL，最后用蒸馏水定容至1 000 mL，最终试剂含0.01 %考马斯亮蓝G- 250，4.7%乙醇，8.5 %磷酸，置于棕色瓶中备用。
1.3.2.3 供试品溶液的制备
精确称取多糖10.00 mg，加蒸馏水溶解定容至10 mL，即为1 mg/mL 供试品溶液。
1.3.2.4 标准曲线的制作
分别精密吸取标准蛋白质溶液0.0、0.02、0.04、0 .06、0.08、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mL 于10mL 试管中，各管加水至1 mL，加入考马斯亮蓝G- 250 溶液5mL，混匀，放置10min，于595 nm 处测定其吸光值。得其线性回归方程Y=4.6632x+0.0617（R2 = 0.9926）。

图1 蛋白质标准曲线
Fig.1 Calibration curve of the chlorella protein
1.3.2.5 样品蛋白质含量的测定
取供试品溶液各1 mL，以空白试剂为参比，按上述标准曲线的测定法，分别测定其吸光度值，计算样品中蛋白质的含量。
2. 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 时间对蛋白质提取率的影响
料液比（g:mL）1∶20，热水作用温度50 ℃，超声清洗仪作用功率10%，考察热水作用时间15、30、60、90、120、150 min，对肉苁蓉蛋白质提取率的影响，结果如图2

图2 时间对蛋白质提取率的影响
Fig.2 Effects of different time on extraction rate of Herba Cistanche protein
从图2可以看出随着提取时间的增长，蛋白质得率逐渐提高，并且提取时间60min和提取时间90min的得率相同，在时间增长至90min后，得率突然降低，这说明提取时间太长，会破坏蛋白质，使得提取率降低。
2.1.2 温度对蛋白质提取率的影响
料液比（g:mL）1∶20，热水作用时间1 h，超声清洗仪作用功率10%，考察热水作用温度30、40、50、60、70、80℃，对肉苁蓉蛋白质提取率的影响，结果如图3

图3 温度对蛋白质提取率的影响
Fig.3 Effects of different temperature on extraction rate of Herba Cistanche protein
由图3可知，在30℃～70℃范围内随着温度的升高，蛋白质得率逐渐升高，70℃后，随着温度的升高，蛋白质得率降低，这说明蛋白质的提取温度不能太高，温度太高会导致蛋白质变性以及一些其它反应的发生，最终导致蛋白质得率降低。
2.1.3 料液比对蛋白质提取率的影响
超声浸提时间60min，温度50℃，超声清洗仪作用功率100%，考察料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25对肉苁蓉蛋白质提取率的影响，结果如图4

图4 料液比对蛋白质提取率的影响
Fig.4 Effects of different ratios of water to raw material on extraction rate of Herba Cistanche protein
由图4可知，随着料液比的增加，蛋白质得率呈增高的趋势，在料液比大于 1∶20时有所降低，这说明提取蛋白质时，料液比不能太低也不能太高。
2.1.4 超声清洗仪作用功率对蛋白质提取率的影响
料液比（g:mL）1∶20，热水作用时间60min，温度50℃，考察超声清洗仪作用功率40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%对肉苁蓉蛋白质提取率的影响，结果如图5

图5 超声功率对蛋白质提取率的影响
Fig.5 Effects of different microwave power on extraction rate of Herba Cistanche protein
由图可知，随着超声作用功率的增加，蛋白质得率先降低后增加，但是当功率达到90%时又明显下降，这说明肉苁蓉蛋白质的最佳提取功率具有一定的范围，功率过低会造成蛋白质的提取不充分过高会导致蛋白质被破坏，从而致使得率的降低。
2.2响应面设计试验结果
2.2.1 响应面设计与结果
根据单因素试验结果，同时考虑到操作方便、节省溶剂及能耗，从而确定选择超声作用时间（X1）超声清洗仪作用功率（X2）热水温度（X3）以及料液比（X4）4 个因素，以肉苁蓉蛋白质提取率为响应值进行优化，根据Box-Behnken 的中心组合试验设计原理，设计4 因素3 水平的试验方案，试验因素和水平设计见表1，试验结果见表2。
表1 试验因素和水平
Table1 factors and levels of Box-Behnken test[7]
因素
单位
低水平
中水平
高水平
时间
min
30
45
60
温度
℃
50
60
70
料液比
mL/mg
15
20
25
功率
%
80
90
100
2.2.2 回归模型的建立与分析
通过SX1S 数据分析软件对表2中数据进行处理，得到回归模型的方差分析结果（表3）以及多元二次回归方程模型（不带编码），其中以肉苁蓉蛋白质的吸光度为响应值Y：
Y=20.21-0.28X1-0.37X2-0.059X3+0.078X4-9.048E-003X1X2+0.081X1X3+0.37X1X4+0.28X2X3-0.19X2X4-0.15X3X4-1.97X12-1.90X22-1.79X32-2.00X42
表2 Box-Behnken 试验设计及结果
Table2 Box-Behnken design and results
序号
时间（min)
功率(%)
温度(℃)
液料比(mg/ml)
得率（%）
1
30
80
60
20
16.63
2
60
80
60
20
16.52
3
30
100
60
20
16.71
4
60
100
60
20
16.58
5
45
90
50
15
16.62
6
45
90
70
15
16.37
7
45
90
50
25
17.32
8
45
90
70
25
16.48
9
30
90
60
15
16.67
10
60
90
60
15
14.73
11
30
90
60
25
16.55
12
60
90
60
25
16.11
13
45
80
50
20
16.58
14
45
100
50
20
16.04
15
45
80
70
20
16.00
16
45
100
70
20
16.58
17
30
90
50
20
16.55
18
60
90
50
20
16.04
19
30
90
70
20
16.60
20
60
90
70
20
16.41
21
45
80
60
15
17.51
22
45
100
60
15
15.57
23
45
80
60
25
17.33
24
45
100
60
25
14.63
25
45
90
60
20
20.21
26
45
90
60
20
20.21
27
45
90
60
20
20.21
28
45
90
60
20
20.21
29
45
90
60
20
20.21
SD=0.68；R2=0.9092；R X1dj 2=0.8185 ；C.V. %=3.99
表3 回归模型的方差分析结果
Table3 The results of variance analysis of regression mode[7]
变异来源
Source
平方和
Sum of
SquX1res
自由度
Degree of
freedom
均方
MeX1n
squX1re
F 值
F VX1lue
P 值
P VX1lue
Prob > F
Model
64.74
14
4.62
10.02
< 0.0001
X1-time
0.92
1
0.92
2.00
0.1792
X2-MicrowX1ve Power
1.65
1
1.65
3.57
0.0795
X3-TemperX1ture
0.042
1
0.042
0.091
0.7677
X4-Luqid/mX1teriX1l
0.073
1
0.073
0.16
0.6967
X1 X2
3.275E-004
1
3.275E-004
7.095E-004
0.9791
X1 X3
0.027
1
0.027
0.057
0.8140
X1 X4
0.55
1
0.55
1.20
0.2919
X2 X3
0.32
1
0.32
0.69
0.4185
X2 X4
0.14
1
0.14
0.31
0.5867
X3 X4
0.089
1
0.089
0.19
0.6676
X12
25.24
1
25.24
54.68
< 0.0001
X22
23.44
1
23.44
50.78
< 0.0001
X32
20.71
1
20.71
44.87
< 0.0001
X42
25.95
1
25.95
56.21
< 0.0001
ResiduX1l
6.46
14
0.64

LX1ck of Fit
6.46
10
0.65

Pure Error
0.000
4
0.000

Cor TotX1l
71.21
28

注： Pr＞F 小于0.05， 模型或考察因素有显著影响； Pr＞F 小于0.01 模型或考察因素有极显著影响；
由方差分析（表3）看出，模型Pr＞F 值小于0.01，表明该模型方程显著，不同处理间的差异极显著，说明该试验方法准确可靠，可以用该回归方程代替真实试验点对试验结果进行分析和预测。模型的复相关系数R2 为99.26%，大于90%，说明模型拟合程度良好，试验误差小，该模型是合适的。由表3 的Pr＞F 值可知：在所选的各因素水平范围内，对结果的影响排序为：超声清洗仪作用功率(X2) >时间(X1) >料液比(X4) ＞热水温度(X3) [8]。表3结果表明：模型的一次项X1，X2 显著，X3，X4 不显著；二次项X12，X22,X32,X42 极其显著；交互项X1 X4，X2 X3显著，X1 X2，X1 X3，X2 X4，X3 X4不显著；结果表明各个影响因素与响应值不是简单的线性关系[10]。根据回归模型作出相应的响应面和等高线如图6~图11 所示。研究表明，等高线的形状可反映出交互效应的强弱，越趋向椭圆表明交互作用越强，越趋向圆形则相反，表明交互作用越弱[10]。比较两组图响应面最高点和等高线可知，在所选范围内存在极值，即响应面最高点，同时也是等高线最小椭圆的中心点[9]。

图6 时间与温度交互作用的响应面和等高线
Fig.6 Effects of time and temperature on extraction rate Herba Cistanche protein
由图6 得，在时间X1与温度X3交互作用等高线中，等高线沿X1轴和X3轴方向变化的趋势基本相同，等高线的形状近圆形，说明因素时间和温度的交互作用较弱[11]。

图7时间与料液比交互作用的响应面和等高线
Fig.7 Effects of time and ratio of water to raw material on extraction rate Herba Cistanche protein
由图7 得，在时间X1与料液比X4交互作用等高线中，等高线沿X1轴方向较沿X4轴方向稀疏，说明因素料液比对肉苁蓉蛋白质的提取率变化比时间变化敏感[11]。

图8时间与功率交互作用的响应面和等高线
Fig.8 Effects of time and microwave power on extraction rate Herba Cistanche protein
由图8 得，在时间X1与超声波作用功率X2交互作用等高线中，等高线沿X2轴和沿X1轴方向趋势基本相同，等高线的形状近圆形，说明因素时间与超声波作用功率的交互作用较弱[11]。

图9 温度与料液比交互作用的响应面和等高线
Fig.9 Effects of temperature and ratio of water to raw material on extraction rate Herba Cistanche protein
由图9 得，在温度X3与料液比X4交互作用等高线中，等高线密度沿X3轴和沿X4轴方向的变化趋势基本相同，等高线的形状很接近圆形，说明因素温度与料液比的交互作用较弱[11]。

图10 温度与功率交互作用的响应面和等高线
Fig.10 Effects of temperature and microwave power on extraction rate Herba Cistanche protein
由图10 得，在温度X3与超声波作用功率X2交互作用等高线中，等高线沿X2轴方向变化的趋势略高于X3，说明因素超声波作用功率的变化对肉苁蓉蛋白质得率影响较温度敏感[11]。

图11 料液比与功率交互作用的响应面和等高线
Fig.11 Effects of ratio of water to raw material and microwave power on extraction rate Herba Cistanche protein
由图10 得，在料液比X4与超声波作用功率X2交互作用等高线中，等高线沿X2轴方向变化的趋势略高于X4，说明因素超声波作用功率的变化对肉苁蓉蛋白质得率影响较料液比敏感[11]。
通过软件分析，得到响应面法优化热水提取肉苁蓉蛋白质的最佳条件为料液比1∶20，提取时间43.97min，温度59.76℃,超声清洗仪作用功率89.01%。在此条件下，蛋白质提取率理论值为20.24%。为检验RSX1 法预测结果的可靠性，采用上述最优提取条件进行多糖的热水提取试验，同时考虑到实际操作的情况，将蛋白质最佳提取条件修正为料液比1：20，提取时间44min，温度60℃，超声清洗仪作用功率90%，3次平行试验得到的实际提取率为19.12%，与理论预测值比较相对误差不到2%，因此，采用RSX1 法优化得到的提取条件参数准确可靠，具有实用价值。
3 结论
热水浸提肉苁蓉蛋白质的最佳提取条件为料液比1∶20，提取时间44min，温度60℃，超声清洗仪作用功率90%，按此工艺，肉苁蓉蛋白质提取率达19.12%。该方法具有提取率高，工艺简单等优点，可为蛋白质的工业化生产提供理论最优条件。

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