BDFACSCalibur流式细胞仪操作基础手册.doc
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1、BD FACSCalibur流式细胞仪FACS101 Handbook本课程介绍表面抗原流式分析相关之基础工作原理。如期望深入了解流式细胞技术应用,请至本企业网站订阅FACSinformation电子报.tw/bdb/index.html。如需要本课程手册,欢迎至本企业网站下载 .tw/bdb/10-5-3-1.html 。如需要免疫荧光染色方法,请至本企业网站下载 .tw/bdb/10-5-4-1.html 。一、BD FACSCalibur基础结构1.1仪器本体:1. 电源开关:在BD FACSCalibur仪器右侧下方,先开启仪器本体,再打开计算机。2. 光学系统:BD FACSCali
2、bur 基础配有一支波长488 nm 氩离子雷射以BD FACSCalibur 基础型为例 FSC Diode 只收488 nm波长散射光 SSC PMT 只收488 nm波长散射光 FL1 PMT 荧光光谱峰值落在绿色范围(波长515-545 nm) FL2 PMT 荧光光谱峰值落在橙红色范围(波长564-606 nm) FL3 PMT 荧光光谱峰值落在深红色范围(波长 650 nm)3. 仪器面板:仪器前方面板右下方有三个流速控制键、及三个功效控制键。流速控制:LO: 样品流速:12 ml /minMED:样品流速:35 ml /minHI: 样品流速:60 ml /min功效控制: RU
3、N:此时上样管加压,使细胞悬液从进样针进入流动室。(正常显示绿色;黄色时表示仪器不正常,请检验是否失压。) STANDBY:无样品或暖机时之正常位置,此时鞘液停止流动,雷射功率自动降低。 PRIME:去除流动室中气泡,流动室施以反向压力,将液流从流动室冲入样品管,连续一定时间后,以鞘液回注满流动室。PRIME 结束,仪器恢复STANDBY状态。4. 储液箱抽屉:在主机左下方之储液箱抽屉。可向前拉开,内含鞘流液筒、废液筒、鞘液过滤器Sheath Filter,及空气滤网 Air filter。请注意气路减压阀VENT TOGGLE之位置。 鞘液筒:在抽屉左侧,容积4升。装八分满鞘液筒,仪器能够运
4、行大约 3小时。筒上装有液面感应器,鞘液用完时,仪器软件上会有显示。鞘液筒盖上有金属环扣,确保鞘液筒密闭。 废液筒:在抽屉右侧,容积4升。筒上装有液面感应器,废液盛满时,仪器软件上会有显示。注意废液可能有潜在生物传染性。 鞘液过滤器:0.22mm过滤器,去除鞘液中杂质,确保进入流动室鞘液是洁净。 气路减压阀:沿箭头方向移动阀门开关,鞘液筒减压,气压恢复正常。在鞘液筒添加鞘液时,需要减压。 空气过滤网:用于过滤冷却雷射空气。5. 上样品区:上样品区是样本管上样位置。它包含三个部分,一个是进样针 Sample Injection Tube,将样本输入流动室,还有就是支撑架 Tube Support
5、 Arm、和液滴存留系统 Droplet Containment System。 进样针:是一根不锈钢管,将细胞从样本针中吸入流动室。进样管外有一套管,是液滴保留系统一部分。 支撑架:用于支撑样本管、并负责开启液滴存留系统。支撑架有三个位置:在样本管之下中位,样本管左侧或右侧。液滴存留系统:系统由支撑架、真空帮浦和外套管组成。当支撑架在左侧或右侧位置时,真空帮浦就会开启,将液体从外管吸入废液筒内。上样时,须注意将支撑架在中位,以避免过多样品被抽吸到废液筒内(当支撑架在中位,真空帮浦停止工作)。更换样品时,让仪器保持RUN模式,使得进样针能够反冲;切换到STANDBY模式前,确保液路已冲洗根本以
6、免碎片沈积到流动室中。1.2 Macintosh计算机和打印机:准备您细胞样品1. 理想样品浓度调至1-10 X 105 cells/ml?通常试验只需0.5 ml样品。2. 细胞样品务必放至BD FALCON 352052 试管中,不然无法上机。3. 上机前务必去除样品中之细胞团块,以预防管路堵塞?可使用附滤网BD FALCON试管 (Cat. No.352235) 或35-55 mm尼龙筛网。4. 供流式分析样品是单细胞悬浮液,而且大部分样品全部需经荧光染色。表面抗原荧光染色方法大致有两种:直接免疫荧光、间接免疫荧光染色。硕士可至本企业网站下载染色方法 .tw/bdb/10-5-4-1.h
7、tml 直接免疫荧光染色 Lysed - No - Wash Procedure Lysed - And - Wash Procedure, SimulTEST & HLA-B27 Peripheral Blood Mononuclear Cell Procedure Leukemia and Lymphoma Procedure 1 Leukemia and Lymphoma Procedure 2, B-cell Clonality Assay 间接免疫荧光染色 滴定抗体浓度 常见试剂5. 如因特殊原因无法下载上述试验方法,请e-mail:或 。二、开机、关机标准操作2.1 FACS Ca
8、libur 开机1. 开启细胞仪电源。2. 开启其它周围配置电源,如打印机及MO机。3. 开启计算机。4. 确定鞘流液筒有八分满FACS Flow,确实旋紧 (鞘液筒容量为4L)。5. 将废液倒掉,并在废液筒中加入200 ml 家用漂白水 (废液筒容量为4L)。6. 将减压阀方向调在加压(Pressurize)位置。7. 排除液流管路和过滤器中气泡。8. 取下样品管,实施 PRIME 功效两次。9. 使用1ml PBS,HIGH RUN 两分钟。10. 可开始分析样品。2.2 FACS Calibur 关机关机前必需动作:清洗进样管和外套管,预防进样管堵塞、或有染料残留。1. 将样品支持架左移
9、,取 2 ml FACSClean(10%Bleach)上样品,让仪器真空系统抽取约 1 ml 液体。2. 将样品支持架回正,按 HI RUN,然后让 FACSClean 清洗管路10分钟。3. 按 Standby,取下样品管,实施 PRIME功效两次。4. 取 2 ml dH2O,反复上述步骤1-3。5. 注意最终只留约 1 ml dH2O 在试管中。6. 按 STANDBY 五分钟,使风扇冷却雷射后,关闭细胞仪(必需动作,以保护雷射光源。)7. 倒掉废液,并回填 200 ml漂白水。8. 将减压阀放在VENT 漏气位置。将鞘流液筒充填至八分满。9. 退出软件“File”“Quit”(如有对
10、话选项,选择“Dont save”)。确定退出计算机中全部BD应用软件,全部数据数据已储存备份。10. 关闭计算机。“Special”“Shutdown”。三、上机分析步骤提议首次试机避免进行大量试验,仅需准备下列样品。(1)Negative Control(不加任何抗体)。(2)CD3-FITC(FL1 单染)。(3)CD19-PE(FL2 单染)。(4)CD3-FITC /CD19-PE(FL1/FL2 双染)。3.1 Calibur 开机1. 先开启细胞仪本体再打开计算机。 *秘技1:如次序相反,仪器和计算机之间无法建立正常通讯,无法实施“connect to cytometer”。 处
11、理之道,二者全部关机、然后以正确方法重开。2. 向前拉开储液箱抽屉,检验鞘液筒、废液筒水量,如需充填鞘液,将减压阀方向调在VENT位置(箭头方向)。3. 仪器会对鞘流液筒打气加压,请确定筒盖确实旋紧。 *秘技2:将减压阀方向调在加压(向前)位置。减压阀如在VENT(箭头方向)位置,按RUN功效键时将显示橙黄色(表示仪器不正常,请检验是否失压),正常为绿色显示。3.2开启CellQuest 软件、编辑试验文件4. 在苹果菜单下点击CELLQuest 开启软件。桌面会出现一Untitled 试验文件,可点击试验文件右上角放大钮,将试验文件窗口放大。5. 从工具板中点击散点图图示。在试验文件空白区点
12、击,拖曳对角线至合适大小,然后放开鼠标。出现散点图对话方框。6. 在出现散点图对话方框中点击Plot Source,选择Acquisition (收取) ,确定X和Y轴参数预设为FSC-H 1024、SSC-H 1024。在颜色方框中点击Multicolor Gating(收取样品时,门内细胞将出现颜色)。点击OK。此时试验文件会出现FSC/SSC散点图。7. 说明:散点图(Dotplot),又称二维散点图是流式分析最常见图谱,它能够显示两个独立参数相互关系。在图中,横坐标X轴为为荧光1强度相对值,单位是道数,纵坐标Y轴则通常表示荧光2或光散射强度相对值。仪器使用者可因应试验需求来修改全部图谱
13、中显示之参数。第一图X和Y轴参数分别设为FSC-H 1024、SSC-H 1024;第二图X和Y轴参数分别设为FL1-H 1024、FL2-H 1024。修改动作为轻击图谱上X和Y轴参数,并依需要选择之(FSC:细胞大小,SSC:细胞折射率,FL1:FITC绿色荧光,FL2:PE橙色荧光,FL3:PerCP红色荧光)。8. 从屏幕上方Plots菜单中选择Dot Plot功效,可复制一个一样大小散点图,在出现对话方框内选择X轴:FL1-H 1024,Y轴:FL2-H 1024。点击OK,FL1/FL2散点图出现。完成后可将重制图移至原图右方。9. 在工具板中选择四象限工具,在FL1/FL2散点图
14、上拖动Quadrant中心将它设定在(x,y)(101,101)处,这些象限将指定阴性/阳性区域。建立仪器和计算机之间通讯10. 从Acquire菜单中选择Connect to Cytometer,此时会出现Acquisition Control 对话方框。假如无法选择Connect to Cytometer,参考秘技 #1。假如没见到Acquisition Control 对话,可到屏幕上方Windows菜单中选择Show Acquisition Control。仪器设置文件注意:试验数据质量,取决于最适化仪器设定文件。仪器设定文件不能在数据收取后再更改,研究人员必需在第一次就使用正确仪器设
15、定文件。仪器设定文件(Instrument settings),含信号器高压(Detector/ Amps),阈值(Threshold),荧光赔偿(Compensation)等仪器条件组合。通常而言,仪器设定次序为Detector/Amps - Threshold - Compensation。11. 检验现有仪器条件,从Cytometer菜单中选择Detectors/Amps。出现 Detectors/Amps窗口。在Detectors/Amps窗口确定FSC和SSC为LIN(线性放大),其它FL1-3为LOG(对数放大),将其拖至空白区。12. 从Cytometer菜单中选择Thresho
16、ld,出现 Threshold 窗口在Threshold 窗口:确定FSC为设阈参数,初步确定预设阈值52。将其拖至空白区。13. 从Cytometer菜单中选择Compensation,确定全部预设数值皆为零。将其拖至空白区。3.3 上样品、设置仪器14. 使仪器处于High RUN,支撑架左移,上阴性对照管样品,支撑架回位。确定Acquisition Control 窗口中 Setup前需打叉或打勾 (即不储存数据),点击Acquire。 调整FSC/SSC探测器(电压)15. 观察FSC/SSC图改变。FSC电压(Voltage)预设为E00,可调整 Amp Gain 从1.009.99
17、 使关键细胞群得以清楚显示(如细胞较大,将FSC电压设置于E-1;较小细胞,将FSC电压设置于E01)。调整SSC电压使关键细胞群得以清楚展现。调整FSC/SSC图标准,在于能得到一独立离散细胞族群,该细胞群不和其它族群、细胞碎片有重迭现象。调整定位后,点击Acquisition Control 窗口中Pause。Gating 圈选细胞检品中,常含有大小不一样、性质相异细胞群体。我们常见前方散射和侧方散射二维位图,即散射光图谱(Scatter Plot),来圈选出不一样细胞群范围,选择性显示出有意义细胞群体,以下图圈选白血球之淋巴细胞族群。16. 在工具板中选择多边形Region,在FSC/S
18、SC散点图上划定淋巴细胞R1 区域(以下图)。分析样品时,区域内细胞应会展现成红色,可移动或改变形状来圈选有意义细胞。假如要删除R1区域,您能够在工具列中点选Gates Region list ,以鼠标点选 R1,再按Delete 键删除R1 区域。删除R1区域后,可用绘图工具板,重画R1。17. 选择期望GateFL1/FL2散点图,从Plots菜单中选择Format dot plot。在出现对话方框内,将No Gate 改选 G1=R1。点击OK。 调整FL1、FL2探测器(电压)18. 点击Acquisition Control 窗口中Restart。在Detector/Amps 窗口中
19、调整FL1、FL2电压,使Negative Control细胞群着落在所选直方图或散点图之100-101处。19. 在Threshold 窗口,合适地提升FSC阈值52,以去除碎片或低阶噪音。唯需注意不要切掉关键细胞族群。 20. 点击Acquisition Control 窗口中Pause、Abort。移去阴性对照管,关闭Detector/Amps、Threshold窗口,我们已设定好有意义细胞群之自体荧光。调整荧光赔偿说明:最适化最终一步是调整光谱重迭。(如是单色荧光试验可跳过此步骤)如是2色样本,必需时需调整FL2-%FL1,FL1-%FL2(若3色样本,必需时需调整FL2-%FL1、F
20、L1-%FL2、FL3-%FL2、FL2-%FL3赔偿)。21. High RUN,换上单染CD3-FITC管。点击Acquisition Control窗口中Acquire。调整FL2-%FL1使FITC阳性细胞在FL1/FL2散点图右下象限。赔偿调整可经过点击来选择或直接拖动滑标上下移动。调整完成,点击Acquisition Control窗口中Pause。22. 移去单染CD3,换上单染CD19-PE管。点击Acquisition Control窗口中Restart。调整FL1-%FL2使PE+细胞在FL1/FL2散点图左上象限。调整完成,点击Acquisition Control窗口中
21、Pause。23. 最终以CD3-FITC/CD19-PE双染样本上机,点击Acquisition Control窗口中Restart,确定三群细胞工整垂直。当您已完成2色荧光之光谱重迭时,点击Acquisition Control窗口中Pause、Abort。24. 移去样本管,换上dH2O管,让仪器暂且处于Standby状态。关闭Compensation窗口。您已完成2色荧光之最适化。3.4搜集试验数据决定储存细胞总数25. 预设之储存细胞总数为10000。如需修改,从Acquire菜单中选择Acquisition & Storage,并在出现窗口功,确定Collection Criter
22、ia从10000 of All,再点击OK。 26. 找个档案匣准备储存数据。从Acquire 菜单中选择Parameter Description,出现Parameter Description对话方框。点击Folder,并在随即出现之对话方框,选择Your Folder或新建活页夹,点击此对话方框Select Your Folder。27. 命名立即储存之文件名:点击Parameter Description对话方框File,出现文件名编辑窗口。在Custom Prefix中:输入文件名1231,点击此对话方框OK。日期为最常见之文件名系统。28. Optional:如有需要,可选择或在P
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- BDFACSCalibur 细胞 操作 基础 手册
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