三维葡萄糖电化学传感器与胶原水凝胶集成实时监测细胞代谢.pdf
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1、156-163CHINESEJOURNALOF APPLIEDCHEMISTRY2024年1月第1期应用化学第41卷D01:10.19894/j.issn.1000-0518.230260三维葡萄糖电化学传感器与胶原水凝胶集成实时监测细胞代谢姚春莹!朱晓艳?刘艳玲1*(武汉大学化学与分子科学学院,武汉430 0 7 2)2(武汉商学院食品科技学院,武汉430 0 56)摘要葡萄糖代谢的实时监测不仅能够提供细胞生长状态信息,还有助于深人理解细胞代谢机制。电化学传感器已成为葡萄糖实时动态测量的重要方法之一,然而,目前报道的葡萄糖传感器大多基于二维电极,很难与三维细胞培养体系良好兼容并进行准确检测。
2、通过在对H,O,还原具有催化作用的多孔电极表面固定葡萄糖氧化酶(COD),制备了-一种灵敏度高、选择性好的三维葡萄糖电化学传感器。然后,将包裹了肿瘤细胞(M CF-7)的胶原水凝胶填充到三维传感器孔隙,构建了兼具细胞三维培养和电化学检测于一体的集成平台。通过实时监测MCF-7细胞培养环境中葡萄糖的浓度变化,实现了肿瘤细胞在抗癌药物作用下葡萄糖代谢能力的实时分析,为细胞能量代谢行为研究提供了一种新的评估方法关键词三维传感器;电化学检测;细胞培养;葡萄糖代谢中图分类号:0 6 57.1文献标识码:A文章编号:10 0 0-0 518(2 0 2 4)0 1-0 156-0 8葡萄糖作为最主要供能物
3、质在大部分细胞中通过有氧途径进行代谢,即葡萄糖在细胞质中被转化为丙酮酸,丙酮酸完全降解成水和二氧化碳,并释放出大量三磷酸腺苷(ATP)2 ;在缺氧条件下,丙酮酸则会在乳酸脱氢酶的作用下生成乳酸并释放较少的ATP,该过程也被称为糖酵解。细胞代谢活动越旺盛,葡萄糖消耗量越多,因此,葡萄糖消耗已经成为评价细胞生长代谢的重要指标,异常的葡萄糖代谢与多种疾病的发生密切相关。在血液中,葡萄糖浓度的偏高或偏低均会引起机体代谢紊乱,诱导糖尿病、心血管疾病等病症的发生 3-41。在神经退行性疾病中,神经元对葡萄糖的摄取降低造成代谢产生的能量减少,长时间的能量供应不足导致突触丢失和神经元死亡 5-7 。肿瘤细胞即
4、使在氧气充足条件下,仍然以糖酵解的代谢方式获取能量,这种反常的低产能糖代谢模式为肿瘤细胞的生长、增殖和转移提供物质基础8-9 。因此,细胞葡萄糖代谢活动的实时连续监测,对细胞代谢机制的理解、药物筛选研究和疾病临床治疗均具有重要意义目前,已经发展了多种分析方法用于细胞葡萄糖浓度的测定,包括荧光光谱法 10 、比色法 、色谱-质谱联用法 12】、拉曼散射法 13 和电化学方法 14 等。其中,电化学生物传感器具有操作简单、可微型化和响应速度快等优势,在细胞15、血液 16 和活体组织 17 葡萄糖含量分析中广泛应用。生物酶催化作用的高效率和特异性使其被广泛应用于电化学传感器构建,目前葡萄糖酶型传感
5、器主要利用高稳定性的葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase,G O D),并借助电子媒介体或者导电材料将酶活性中心的电子传递到电极表面,实现对葡萄糖的高灵敏、选择性检测。近些年,纳米科技的飞速发展为新型葡萄糖电化学传感器构建提供了更多选择,例如纳米颗粒 18 、导电聚合物 19 、碳材料 2 0 和复合纳米材料 2 1-2 3 等引人电极界面,大大地提高了葡萄糖酶电极的灵敏度。尽管如此,目前所报道的传感器对细胞葡萄糖代谢水平实时监测仍然面临挑战,这是由于传统平面培养的细胞在结构和功能方面与体内三维基质环境自然生长的细胞相差甚远,而现有的传感器大多是基于二维电化学传感器,很难与细胞三维培养
6、体系集成并进行细胞代谢活动实时监测在前期工作中 2 4),通过静电吸附和电化学沉积等技术,依次在三维多孔聚二甲基硅氧烷(PDMS)支架表面组装导电聚合物聚(3,4-乙烯二氧噻盼)(PEDOT)碳纳米管(CNTs)和普鲁士蓝纳米颗粒(PBNPs),2023-08-30收稿;2 0 2 3-11-18 接受国家自然科学基金(No.22122408)资助*E-mail:157第1期姚春莹等:维葡萄糖电化学传感器与胶原水凝胶集成实时监测细胞代谢制备了对H,O,电化学还原反应具有催化作用的三维电极(PCP)。本研究工作在该电极表面进一步固定GOD,构建了三维葡萄糖电化学传感器GOD/PCP,将包裹了肿瘤
7、细胞(MCF-7)的胶原水凝胶填充到传感器的孔隙,搭建了兼具三维细胞培养和电化学检测功能的集成平台。细胞培养过程中,电极表面的GOD能够催化氧化环境中的葡萄糖,产生葡萄糖酸和电活性分子H,O,H,O,发生电化学还原反应时产生的电子通过媒介分子普鲁士蓝传递电极表面,从而实现传感器对三维细胞培养体系葡萄糖消耗水平的实时动态监测(图1)。PCPPCP/GODGODimmobilizationCollagen&cellOH-PB(red)HOPBGlucose(ox)GODeGluconlic02acidGODPBNPsCNTsPEDOT3Dcellculture图1三维葡萄糖电化学传感器构建及细胞代
8、谢检测原理示意图Fig.1 Schematic illustration of the fabrication of 3D glucose electrochemical sensor and the detection principle ofglucose metabolism in 3D cell culture1实验部分1.1仪器和试剂CHI660A型电化学工作站(上海辰华有限公司);GeminiSEM500型场发射扫描电子显微镜(FESEM,德国Zeiss公司);Nicolet-6700型傅里叶变换红外光谱仪(FT-IR,美国ThermoFisher公司);LSM900型激光共聚焦荧
9、光显微镜(德国Zeiss公司);PDC-002型等离子体清洁机(美国Herrick公司);HC-2062型高速离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司);Direct-Q3型超纯水仪(美国Millipore公司)。导电聚合物聚(3,4-乙烯二氧噻吩):聚(苯乙烯磺酸盐)(PEDOT:PSS,Cl e v i o s PH 10 0 0)分散液购自武汉卓鑫科技有限公司。单壁碳纳米管(SWCNTs,外径 2 nm,长度5 30 m)购自南京先丰纳米材料科技有限公司。PDMS交联剂及预聚体购自美国MomentivePerformanceMaterials公司。泡沫镍模板(厚度1.0mm)购自昆山嘉亿盛电
10、子新型材料有限公司。丙酮(CH,CHOCH,)、无水乙醇(CH,CH,OH)、硝酸(H NO.)、盐酸(HCI)、氯化钾(KCI)、二甲基亚砜(DMSO)、十二水合磷酸氢二钠(Na,HPO12H,O)、铁氰化钾(K,Fe(CN)。I)、磷酸二氢钾(KH,PO.)和氯化钠(NaCI)购自国药集团化工试剂有限公司。羧甲基纤维素钠(CMC)氯化铁(FeCl)、聚乙二醇二缩水甘油醚(PECDE)和葡萄糖购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。尿酸(Uricacid)购自东京化成工业株式会社(日本)。GOD、聚二烯丙基二甲基氯化铵、多巴胺(D o p a mi n e)、抗坏血酸(Ascorbic acid
11、)、乙酰胆碱(Acetylcholine)、牛血清白蛋白、聚乙烯亚胺、乳酸(L a c t a t e)、果糖(Fructose)和半乳糖(Galactose)均购自美国Sigma-Aldrich公司。实验中所使用的试剂均为分析纯,所有实验用水为超纯水(电阻率18.2 MQcm)。158第41卷应用化学1.2实验方法1.2.1三维葡萄糖电化学传感器构建三维多孔PCP电极根据前期发表工作 2 4 制备,步骤简单概括为:首先,采用PDMS预聚体复制泡沫镍多孔结构,通过离心、固化和刻蚀等步骤制备三维多孔PDMS支架;然后,通过静电组装、疏水作用和化学沉积方式,在PDMS支架表面依次固定PEDOT、C
12、NT s 和PBNPs,得到多孔PBNPs/CNTs/PEDOT(PCP)电极。在此基础上,通过交联剂PEGDE将COD固定在三维电极表面,形成酶型三维葡萄糖电化学传感器GOD/PCP1.2.2传感器与细胞三维培养体系集成将胶原溶液与DMEM完全培养基混合均匀并调节pH值至中性,加人2 10 cell/mL的MCF-7细胞悬浮液,使得混合液中胶原的终浓度为1.0 mg/mL,并立即将混合液灌注到三维GOD/PCP传感器孔隙中,并确保液体浸没整个传感器。然后,将传感器放置于恒温培养箱中,使胶原溶液在传感器孔隙中完全凝胶化。MCF-7细胞在胶原水凝胶中培养一定时间后,进行活性染色和显微成像。1.2
13、.3细胞葡萄糖代谢实时监测MCF-7细胞与胶原溶液混合以及注入GOD/PCP骨架过程与上部分步骤一致,待细胞稳定2 h后,吸出培养基,并使用无菌PBS缓冲溶液静置清洗。以GOD/PCP电极为工作电极,Ag/AgCl电极为参比电极,Pt电极为对电极,在恒定电压为0.0 V条件下,通过安培计时电流法进行检测。检测过程中PBS缓冲液中加入紫杉醇抗癌药物,使得紫杉醇药物的最终浓度为10 和10 0 mol/L。而对照组则是加人相同体积PBS缓冲液或没有细胞存在的条件下加人相同体积紫杉醇溶液。2结果与讨论2.1GOD/PCP电极的制备与表征PCP电极按照文献 2 4方法制备,图2 A为PCP电极的SEM
14、图片,结果显示其为三维多孔支架结构,孔径尺寸在2 0 0 m左右。图2 B进一步显示其表面粗糙、分布有纳米颗粒聚集物,为PBNPs。PCP电极修饰葡萄糖酶GOD后,依然保持清晰、连续和贯通的多孔结构(图2 C),有利于后续胶原水凝胶灌人及细胞三维培养。同时,相较于PCP电极高倍数SEM结果,GOD/PCP电极的PBNPs颗粒表面附着一层薄膜(图2 D),可能是GOD被固定在电极表面所形成的蛋白膜。dod100um100mm图2(A、B)三维PCP电极和(C、D)G O D/PCP电极在不同放大倍数下的扫描电子显微成像图片Fig.2SEM images at different magnific
15、ations for(A,B)PCP electrode and(C,D)GOD/PCP electrode接着,通过傅里叶变换红外光谱仪对COD/PCP电极的特征官能团进行表征(图3)。PCP电极在2082cm-处出现的吸收峰(黑线),对应于普鲁士蓝中Fe-CN-Fe*的C=N伸缩振动峰;GOD/PCP电极159第1期姚春莹等与胶原水凝胶集成实时监测细胞代谢(红线)在16 52、1542 和110 8 cm-1处的吸收峰,分别对应于葡萄糖氧化酶中酰胺基团的“C一0”伸缩振动峰、“N一H弯曲振动峰,以及可能归属于PEGDE上的“C一O一C伸缩振动峰。以上结果充分证明了GOD成功修饰在三维PCP
16、电极表面。PCPGOD/PCP2082154211081652240018001200600a/cm-1图3PCP电极和GOD/PCP电极的FT-IR谱图Fig.3FT-IR spectra of PCP electrode and GOD/PCP electrode为考察GOD/PCP传感器对目标分子的电化学响应能力,采用循环伏安法记录了PCP、G O D/PCP电极在2 mmol/L葡萄糖溶液的循环伏安(Cyclicvoltammetry,CV)曲线。如图4A所示,PCP电极表面没有固定葡萄糖氧化酶时,电极在PBS溶液和2 mmol/L葡萄糖溶液中的循环伏安行为几乎一致,仅在0 0.2 V
17、之间出现普鲁士蓝的典型氧化还原峰。而修饰了葡萄糖氧化酶的GOD/PCP电极,在2 mmol/L葡萄糖溶液中0 V处普鲁士蓝的还原峰电流显著增加(图4B)。以上电化学结果再次证明,葡萄糖氧化酶已成功修饰在PCP电极表面,且对葡萄糖具有良好的电化学响应性能。AB-PCPinPBS0.2GOD/PCPinPBS0.2PCPin2mmol/LGlucoseGOD/PCPin2mmol/LGlucose0.10.10.00.0-0.1-0.1-0.2-0.2-0.4-0.20.00.20.4-0.4-0.20.00.20.4Potential/VPotential/V图4(A)PCP电极和(B)G O
18、D/PCP电极分别在PBS和2 mmol/L葡萄糖溶液中的CV曲线,扫速均为10 mV/sFig.4 CVs of(A)PCP electrode and(B)GOD/PCP electrode in PBS(black)and 2 mmol/L glucose(red)solutionwith a scan rate of 10 mV/s2.2GOD/PCP电极的电化学传感性能为了进一步考察GOD/PCP电极对葡萄糖的传感性能,采用计时电流法表征了GOD/PCP电极对一系列浓度梯度葡萄糖的安培响应。在搅拌条件下,通过连续加入不同浓度的葡萄糖标准溶液,得到图5A中所示计时电流响应曲线。GOD/
19、PCP电极对葡萄糖的响应速度较快,约在3s内便达到电流稳态,且在0.0 5 5.0 mmol/L浓度范围内表现出灵敏电流响应。另外,根据图5B线性方程相关系数R=0.998推断,传感器对葡萄糖的响应在0.0 5 5.0 mmol/L浓度范围内呈良好线性关系,计算得到的检测灵敏度为10.0 A/(mmo l L),检测限为0.0 2 mmol/L。以上电化学结果表明,三维GOD/PCP传感器对葡萄糖具有优良的电化学检测性能,为后期实时监测细胞葡萄糖消耗量奠定了基础。细胞在生命活动中产生的多种类型部分代谢物,可能会干扰电极对葡萄糖的检测,因此,选用了一些典型的潜在代谢物和电活性物质对COD/PCP
20、电极进行了抗干扰测试,包括果糖、半乳糖、乳酸、乙酰胆碱、尿酸、多巴胺和抗坏血酸。利用安培计时电流法比较了GOD/PCP电极对10.0 mmol/L干扰160第41卷应用化学物质和1.0 mmol/L葡萄糖的响应图5C),可见即使这些干扰物质的浓度为葡萄糖的10 倍,GOD/PCP电极对葡萄糖的电流响应远大于干扰物分子。这得益于CGOD对底物葡萄糖的高效选择性以及PB对产物H,O,优异的电催化性能,使得三维GOD/PCP电极在较低电位(O.OV)下实现葡萄糖高选择性检测0A0.1mmol/L0,2mmol/L60BC1.0mmol/L11.0mmol/L10.010.0mmol/L0.05mmo
21、l/L300.5mmol/L408.0I/IVVI/IV2.0mmol/L+=10.93.x-6.17R-0.9986.0-60205.0mmol/L4.0-9002.015025035045055001.02.03.04.05.0Time/sc/(mmol-L-l)图5(A)G O D/PCP电极对不同浓度葡萄糖标准液的安培响应曲线,施加电位为O.OV;(B)G O D/PCP电极对葡萄糖响应的校准曲线;(C)G O D/PCP电极对1.0 mmol/L葡萄糖和10.0 mmol/L干扰物质安培响应的统计图(n=5)Fig.5(A)A mp e r o me t r i c r e s p
22、o n s e s o f CO D/PCP e l e c t r o d e t o a s e r i e s o f i n c r e a s i n g g l u c o s e c o n c e n t r a t i o n s i n PBSsolution at a potential of O.O V(vs.Ag/AgCI);(B)Corresponding calibration curve of GOD/PCP electrode to glucose;(C)Statistical results of amperometric response of COD/P
23、CP electrodes to 1.0 mmol/L glucose and 10.0 mmol/Lpotential interfering substances(n=5)2.3GOD/PCP电极内的细胞三维培养体内肿瘤细胞生长在周围充满基质的三维微环境,本工作选择胶原作为肿瘤细胞培养基质。将乳腺癌细胞MCF-7与I型胶原混合均匀并填充在GOD/PCP传感器空隙,形成三维电化学传感和细胞培养体系的集成平台。为了便于观察细胞在三维葡萄糖传感器内的分布情况和生长状态,采用交联法将Cy3标记的链霉亲和素固定在PCP支架,使其被黄色荧光分子标记。细胞在传感器内培养2 4h后,使用细胞活性染色剂钙黄
24、绿素(Calcein-AM,绿色)和死细胞核染色剂碘化丙啶(PI,红色)对MCF-7细胞进行染色(图6 A)。共聚焦荧光成像结果显示,MCF-7细胞在黄色支架空隙内均匀分散,且在不同高度均有分布(图6 B)。另外,荧光成像结果显示MCF-7细胞几乎全部保持高活性(绿色荧光),表明该三维传感器的存在不影响细胞自身生长状态B20040020000080060012004001000800600200Xum400200.um20um200图6(A)G O D/PCP电极(黄色,Cy3标记)与MCF-7细胞(绿色,Calcein-AM染色)三维培养体系集成的共聚焦成像图;(B)M CF-7 细胞培养2
25、 4h后被Calcein-AM和PI染色的荧光成像图Fig.6(A)3D reconstruction from confocal microscope images of MCF-7 cultured in the integrated platform andlabeled with Calcein-AM(green)and PI(red)for cell and Cy3(yellow)for GOD/PCP electrode;(B)Fluorescentimage of MCF-7 cultured in the platform for 24 h and labeled with C
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